[发明专利]一种磁性固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯类化合物的方法

说明书

本发明提供一种纳米复合磁性材料固定化脂肪酶制备植物甾醇酯的方法。在磁性纳米材料四氧化三铁外表面包裹具有多糖链结构且富有丰富官能团的壳聚糖，再以具有优异柔性结构和生物相容性的双醛纤维素为大分子交联分子共价固定经离子液体型表面活性剂活化的脂肪酶。此方法制备的有机‑无机磁性纳米复合材料固定化酶具有催化活性高、分离方便且重复使用性好等特点，可用于催化植物甾醇与脂肪酸发生酯化反应制备植物甾醇酯。本发明提供了一种绿色高效的合成植物甾醇酯的新方法。

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种磁性固定化脂肪酶在有机相中催化植物甾醇与脂肪酸进行酯化反应合成植物甾醇酯的方法。

背景技术

植物甾醇是一种以环戊烷全氢菲为骨架的天然化合物，具有抗氧化活性、治疗骨关节炎、降低低密度脂蛋白胆固醇吸收等特点。植物甾醇水溶性和脂溶性较差，吸收利用率低，酯化后的植物甾醇吸收利用率比游离型植物甾醇约提高了5倍，可以显著预防小鼠的高血脂症和动脉硬化，可以通过调节磷脂类和胆汁酸类的小分子代谢物含量来改善非酒精性脂肪肝(NAFLD)的发生。

目前，文献报道酶催化合成植物甾醇酯的工艺普遍存在反应时间长、酶重复使用性能差，植物甾醇酯的收率较低等问题。2016年，霍振宇等人对没食子酸植物甾醇酯的合成工艺进行研究，将Lipozyme435脂肪酶催化植物甾醇与没食子酸反应，55℃水浴震荡72h后，植物甾醇的酯化率为79.7％(王楠楠，张大准，董发才.磁性壳聚糖的制备及在脂肪酶固定的应用[J].化学研究，2017，28(02):247-53.)。2019年，周蕊等人以壳聚糖-戊二醛为载体固定褶皱假丝酵母脂肪酶，虽然脂肪酶的稳定性有所提升，但脂肪酶的重复使用性不高，循环使用4次后只保留了20％左右的初始酶活力，并且在有机溶剂中的耐受性也不高，在正庚醇中浸泡120天后固定化酶的酶活只保留32.2％(周蕊，邢炎华，王燕.以壳聚糖-戊二醛为载体柔性固定假丝酵母脂肪酶candida rugosa lipase[J].当代化工，2019，48(8):13.)。

Fe₃O₄磁性纳米材料具有低毒性、成熟的合成技术、良好的磁性响应能力以及易于表面修饰等特点被广泛应用于酶、蛋白、抗体和药物载体的研究。作为纤维素衍生物，双醛纤维素具有良好的生物相容性，可将其作为功能有机高分子交联剂与酶分子实现共价结合，实现酶分子的柔性固定，稳定酶分子的活性构象。表面活性剂是具有两亲结构的分子，可以呈现出特有的界面活性，从而诱导酶分子中的盖子结构打开，使底物进入酶分子催化中心，提高酶的催化活性。离子液体具有很强的溶解性，较好的稳定性和对环境友好等特点，很多种酶在离子液体中显示出了很好的活性和稳定性，其在生物催化领域成为研究热点。本发明使用离子液体型表面活性剂可以将两者的特点结合，提高酶的催化活性和稳定性。

植物甾醇酯可通过植物甾醇与脂肪酸直接酯化、与其对应的酸酐或酰氯酯化以及酯交换等四种方法制得，其中直接酯化法因其原料易得和工艺相对简单等特点在合成过程中最为常见。张硕等人在N₂保护下，以摩尔比为1.8:1的油酸和豆甾醇为底物，3.0％KHSO4+1.0％ZnO催化反应，反应温度150℃，反应7小时后，植物甾醇的酯化率达到92.17％(张硕，杨亦文，邢华斌，等.复合催化剂在油酸豆甾醇酯合成中的应用[J].化工学报，2015，8(66):3078-83.)。化学法通常有90％以上的收率，反应速度快，同时也存在反应温度高，在高温下会氧化以及脱水生成副产物，且催化剂会有少量残留等问题；而酶催化法具有反应条件温和，副产物少，对环境污染小等特点，是近年来被广泛关注的一种绿色、高效的合成途径。

发明内容

本发明提供一种以Fe₃O₄-壳聚糖-双醛纤维素三层结构的有机-无机纳米复合材料固定离子液体型表面活性剂活化后的脂肪酶为催化剂，催化植物甾醇和脂肪酸酯化来制备植物甾醇酯。该方法可在有机相中进行，反应条件温和，植物甾醇酯收率高，固定化酶催化活性高、重复使用性能好。