[发明专利]一种磁性固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯类化合物的方法

权利要求书

1.一种固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯的方法，其特征在于，所述磁性纳米复合材料固定化脂肪酶的制备方法如下：以壳聚糖包裹的磁性纳米颗粒四氧化三铁为基质材料，利用Schiff base反应与双醛纤维素反应，生成Fe₃O₄-壳聚糖-双醛纤维素三层结构的磁性纳米复合材料载体；添加表面活性剂为摩尔比为1:1的十二烷基甜菜碱型离子液体和PEG550的混合物到溶有脂肪酶的磷酸缓冲溶液中，超声反应后，得到表面活性剂活化后的脂肪酶混合溶液；

将磁性纳米复合材料载体加入脂肪酶混合溶液中，震荡混合后，磁性分离得到高活性、高热稳定性和高耐受性的固定化脂肪酶；在反应器中加入有机溶剂和固定化脂肪酶，加热、搅拌条件下加入脂肪酸和植物甾醇，进行酯化反应。

2.根据权利要求1所述的磁性纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯的方法，其特征在于，所述磁性纳米复合材料具体制备步骤包括：

（1）共沉淀法合成磁性纳米四氧化三铁粒子，将4~6 g六水合氯化铁和5~7 g四水合氯化亚铁溶于一定量的去离子水，充分震荡混合后，加入一定浓度的NaOH溶液，调pH为10，继续搅拌1.5h后进行磁分离并用去离子水洗涤至中性，45℃烘干，得到黑色固体-磁性纳米四氧化三铁粒子；

（2）将2~4 g的壳聚糖加入到一定量的乙酸溶液中充分搅拌，获得均匀地壳聚糖溶液，将步骤（1）中得到的Fe3O4磁性纳米粒子加入到溶液中，超声0.5h后加入NaOH溶液调节pH至中性；磁性分离后去离子水洗涤并干燥，得到壳聚糖包裹的磁性纳米四氧化三铁粒子；

（3）将1~3 g二醛纤维素溶解到一定体积的去离子水中，充分搅拌得到均匀溶液；将（2）中得到的磁性壳聚糖纳米粒子加入该溶液中，充分搅拌反应，过滤所得产物于45℃烘箱干燥，获得Fe₃O₄-壳聚糖-双醛纤维素的固定化酶载体。

（4）将0.5~1g脂肪酶溶于50mL的磷酸缓冲溶液中，将2%~8%浓度的摩尔比为1:1的十二烷基甜菜碱型离子液体和PEG550的混合物溶液加入反应烧瓶中，超声0.25h后，将磁性纳米复合材料载体加入脂肪酶混合溶液中，震荡混合后，磁性分离得到固定化脂肪酶。

3.根据权利要求1和2所述的磁性纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯的方法，其特征在于，所述固定化的脂肪酶为褶皱假丝酵母脂肪酶，南极假丝酵母脂肪酶B，洋葱假单胞菌脂肪酶，洋葱伯克霍尔德氏菌脂肪酶或猪胰脂肪酶中的一种。

4.根据权利要求1所述的磁性纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯的方法，其特征在于，所述固定化脂肪酶催化酯化反应的脂肪酸为油酸，亚油酸，亚麻酸，棕榈酸，硬脂酸中的一种或混合脂肪酸。

5.根据权利要求1所述的磁性纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯的方法，其特征在于，所述反应的溶剂为庚烷，异辛烷，环己烷或正己烷中的一种。

6.根据权利要求1所述的磁性纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯的方法，其特征在于，所述的植物甾醇与脂肪酸的摩尔比为1:1.2~1:3。

7.根据权利要求1所述的磁性纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯的方法，其特征在于，所述的固定化脂肪酶在所述反应中添加量按底物总质量百分比为1%~20%；所述反应的反应温度为35℃~70℃；所述反应的反应时间为6h~24h。

8.根据权利要求1所述的磁性纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯的方法，其特征在于，所述表面活性剂为摩尔比为1:1的十二烷基甜菜碱型离子液体和PEG550混合物，所述固定化的脂肪酶为褶皱假丝酵母脂肪酶，所述固定化脂肪酶催化酯化反应的脂肪酸为油酸，所述反应的溶剂为正己烷，所述的植物甾醇与脂肪酸的摩尔比为1:1.5，所述的固定化脂肪酶在所述反应中添加量按底物总质量百分比为5%，所述反应的反应温度为50℃。

9.根据权利要求1所述的磁性纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯的方法，其特征在于，固定化脂肪酶的回收和重复使用性，包括：

（1）外加磁场，可实现对磁性纳米复合材料固定化脂肪酶快速有效进行聚集回收；

（2）经过10次的重复使用后，磁性纳米复合材料固定化酶仍保持较好的活力，保留了初始活力的85%~95%。