[发明专利]一种消减全血环孢素测定的基质效应的分析方法

说明书

本发明属于分析技术领域，具体公开了一种消减全血环孢素测定的基质效应的分析方法，将待测样品和铷盐混合后电离，使样品中的环孢素形成Rb⁺‑Cy加合物，随后再进行质谱分析；所述的铷盐为铷离子的单羧酸根盐。本发明创新地发现，在铷离子的单羧酸根盐下，基于其特殊的离子特性以及电离特性，能够使所述的Rb⁺意外地优先和环孢素电离加合形成Rb⁺‑Cy加合物，能够竞争抑制分析体系中残留的Na⁺、K⁺等干扰离子，使环孢素在电离阶段按照预期、可控的方向进行，保持定量目标离子丰度的稳定性，从而实现消减环孢素全血样品基质效应的目的。

技术领域

本发明属于分析技术领域，技术设计环孢素的测定方法。

背景技术

环孢素A(cyclosporin A，CyA)是一种从丝状真菌次级代谢产物中分离出来的环状十一肽，具有高度疏水性。因其具有优秀的免疫抑制作用，1982年起应用于移植物抗宿主病的治疗，开启了器官移植的CyA时代。此外，CyA对银屑病、类风湿关节炎、干燥综合征等自身免疫性疾病也有很好的治疗价值。尽管后来不断有新的免疫抑制剂问世，但CyA目前仍然是全球器官移植和自身免疫疾病处方量最大的免疫抑制剂。不过，CyA的临床应用存在比较大的两个问题，其一是其治疗指数窄，血药浓度过低则免疫抑制不充分，容易发生移植物排斥反应或全身免疫反应，而血药浓度过高则容易继发感染、严重的肝肾毒性以及全身器官毒性反应。其二是其生物利用度和体内代谢易受多种因素的影响，血药浓度波动幅度较大，剂量与血药浓度相关性不高。为了保障疗效、降低毒副反应，常规需要监测其全血浓度来进行个体化用药调整。

用于CyA治疗药物监测(TDM)的方法主要有免疫法、液相色谱-紫外法(LC-UV)和液相色谱-质谱联用法(LC-MS)。其中，LC-UV因为灵敏度低、抗干扰能力差，不适合大样本快速检测。荧光偏振免疫法、酶联免疫分析法、化学发光微粒子等免疫分析法由于简便无需专业分析人员操作，在CyA的临床测定中应用较多。免疫法的缺点是特异性不高，常常因为药物代谢物或内源性物质与抗体的交叉反应而高估CyA的浓度和产生较大的偏差，也不能像色谱法那样可同时测定两种或以上药物。另外，免疫法因为需要特定的试剂盒，其检测成本一直居高不下、至少是液质联用法的2倍或以上。液质联用法兼具液相色谱的高分离能力和质谱的高分析能力，特别是基于电喷雾电离的液质联用法具有高选择性、高灵敏度、高通量的特点，不仅适合CyA的日常TDM，也是其药代动力学和体内代谢、类似物开发等探索性研究的首选，还是免疫法等间接检测法的金标准，因此，液相色谱-电喷雾电离-串联质谱联用法(LC-ESI-MS/MS)定量分析CyA相比于其他分析手段具有更强的技术优势和成本优势，国内外的工作实践以及近年发表的大量有关环孢素的分析文献充分反映这一状况。

从采用LC-ESI-MS/MS技术以来，生物样品CyA的定量检测似乎变得轻松简单，但随之而来的基质效应问题不容忽视。基质效应是指在液质联用分析中，由于色谱共洗脱物所引起的目标分析物的质谱离子化效能(质谱响应)的抑制或增强，一般以抑制多见。对于液质联用技术，分析物离子化过程的高效和稳定是其灵敏、准确分析的重要基础，基质效应的出现对定性和定量分析都有不利影响，尤其影响定量方法的重现性、线性、和准确性，因此也被称为电喷雾质谱定量分析的致命弱点。文献和我们前期工作中均发现全血等生物基质严重劣化CyA电喷雾离子化的效率和稳定，Salm P和BuchwaldA通过柱后灌注法观察到人全血基质对CyA的电喷雾质谱信号抑制达60％左右。Guada M等分析大鼠生物样品时，发现全血和组织匀浆中CyA信号强度分别仅为纯溶液中的64％和25％。Bogusz MJ等和NilsT.Vethe等报道人全血基质引起CyA信号抑制程度在20％左右。Koster RA等对干血点中CyA的测定显示约-64％的基质效应。我们最近的研究显示CyA全血基质效应在-34％～-74％之间。上述研究报道表明CyA的生物基质效应非常严重，是建立灵敏、准确和稳健的分析方法不可回避的重大障碍。除CyA以外，一些其他物质的LC-ESI-MS/MS分析也存在明显的基质效应，基质效应实际上是包括软电离为基础的液质联用分析的共同问题，但由于电喷雾质谱的广泛应用而表现最为突出。