[发明专利]长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞的诱导和离体培养方法

说明书

本发明公开了一种长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞的诱导和离体培养方法，其诱导方法包括以下步骤：长春花根尖切除根冠，接种到诱导培养基上，黑暗培养，外植体中干细胞层增殖生长形成细胞团；将分层后的的干细胞层转移至继代培养基培养10‑15天，完全黑暗培养；然后再转移至新的继代培养基中，相同条件下培养10‑15天，获得细胞形态稳定的长春花干细胞系。本发明利用长春花根顶端分生组织来诱导建立长春花干细胞培养体系，在一定的条件下，可以稳定的传代培养，无表观遗传变异。本发明建立的长春花干细胞培养体系具有生长速度快、遗传稳定等特点，并且初步实现10L生物反应器培养。

技术领域

本发明涉及长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞的诱导和离体培养方法。

背景技术

长春花为夹竹桃科长春花属植物，已从中发现了超过130种以上的生物碱，具有多种药理活性，其中一些生物碱药物已获批准上市，如降压药物阿玛碱、抗肿瘤药物长春碱和长春新碱。

目前，人们获得这些药物的来源主要从原植物提取，但长春花的生长周期较长，且受到环境和气候的影响，而且长春碱、长春新碱等生物碱在植物中的含量极低，只有百万分之几到万分之几。此外，长春花中的生物碱有超过130种以上，生物碱成分极为复杂，这些因素使得获取单一成分的药用活性成分成本极高。同时，这些生物碱的化学结构比较复杂，人工合成生物碱的成本极高，且人工合成带来的环境污染问题也比较严重。

随着中药生物技术的进步，利用植物细胞和组织培养技术结合生物反应器技术大规模工业化规模生产重要的药用活性成分已经实现，如利用离体悬浮培养的红豆杉细胞可以工业化生产抗癌药物紫杉醇，利用悬浮培养的鬼臼细胞可以工业化生产鬼臼毒素。

目前，研究人员已建立了离体培养的长春花愈伤组织和毛状根，并利用生物反应器对愈伤组织和毛状根进行培养，用于生产长春碱和长春新碱，但均未获得成功。

由于长春花愈伤组织和毛状根在诱导建立过程中都经历过脱分化过程，在长期培养后，二者容易发生遗传变异，表现出生长越来越缓慢，阿玛碱、长春质碱等次生代谢产物含量越来越低或者检测不到。因此，建立遗传稳定，生长迅速和次生代谢产物产量高的细胞系是植物细胞培养亟待突破的难点。

植物细胞的全能性使得普通的植物细胞可以在一定条件下发育形成植物组织以及完整的植株。因此，植物干细胞是否存在一直是有争议的。近年来的研究表明，植物干细胞存在于植物的茎顶端分生组织、根顶端分生组织和维管形成层分生组织中，是一类原始的细胞群，具有持续分裂和分化形成不同组织细胞和功能细胞的能力。根据植物干细胞的分裂和分化特性，可以分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。

根据植物根尖的发育特征，将其分为4个区域：根冠、分生区、伸长区和成熟区，这4个区域只存在于根尖的前几毫米。在植物的根尖，静止中心是根所有组织的最原始来源，为全能干细胞。在静止中心周围，存在一些多能和单能干细胞，主要包括：根冠起始细胞、表皮-侧生根冠起始细胞、皮层-内皮层起始细胞、维管组织起始细胞。静止中心是一些有丝分裂不活跃的细胞，但可以维持周围其他起始细胞处于无限分裂且不分化的状态。植物的主根由根顶端分生组织的干细胞不断分裂分化而形成的。

研究表明，植物干细胞具有遗传信息稳定、细胞生长稳定，且次生代谢产物产量较高，是一种理想的用于生产次生代谢产物的细胞来源。因此，建立植物干细胞培养体系，提高植物干细胞诱导成功率，可以实现植物干细胞的商业化应用。

中国专利申请CN106148267A公开了长春花茎形成层来源的干细胞的诱导及分离方法，该方法先从长春花的茎中获得形成层组织，并在含有萘乙酸(NAA)的培养基中培养、分离获得茎形成层干细胞。然而，茎形成层来源的长春花干细胞能否产长春碱、产长春碱的能力如何，这些问题上述专利都未涉及。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞的诱导方法。