[发明专利]长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞的诱导和离体培养方法

权利要求书

1.一种长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞的诱导方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)切取长春花的根尖，清洗干净，灭菌，然后置于抗褐化保存液中保存1-3h；

(2)将经过抗褐化处理的长春花根尖切除根冠，然后接种到诱导培养基上，培养7-16天，培养温度26-30℃，湿度60-70％，完全黑暗培养，经过诱导培养，外植体中干细胞层增殖生长，继而在根尖外植体周围的培养基上形成小的细胞团；

所述的诱导培养基是含有3.0-4.0g/L结冷胶、2.0-4.0mg/L NAA、2.0-3.0mg/L 2,4-D的MS培养基，pH值为5.6-5.8；

(3)将分层后的的干细胞层转移至继代培养基培养10-15天，继代培养的条件为：温度26-30℃，湿度60～70％，完全黑暗培养；然后再转移至新的继代培养基中，相同条件下培养10-15天，获得细胞形态稳定的长春花干细胞系；

所述的继代培养基是含有3.0-4.0g/L结冷胶、0.5-1.0g/L活性炭、2.0-4.0mg/L NAA、2.0-3.0mg/L 2,4-D的MS培养基，pH值为5.6-5.8。

2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于：步骤(1)所述的抗褐化保存液是含有150-250mg/L柠檬酸、100-500U/mL青霉素、200-500mg/L链霉素的MS培养基，pH值为5.6-5.8。

3.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于：步骤(1)所述的长春花为1-2年生，7-9月采集。

4.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于：步骤(1)所述长春花，其根部中长春碱含量高于100μg/g干重。

5.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于：步骤(1)所述根尖的长度为0.5-3cm，含有根顶端分生组织。

6.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于：步骤(1)所述的灭菌，先用70-75％(V/V)乙醇溶液浸泡20-100s，然后用0.02-0.06％质量体积比的HgCl₂溶液浸泡2-10min，最后用无菌双蒸水将消毒剂冲洗干净。

7.一种长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞，其特征在于是由权利要求1-6任一项所述的方法制得。

8.一种长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞的离体培养方法，其特征在于包括以下步骤：

取200-2000mL MS液体培养基，按接种量50-80g/L接种权利要求7所述的植物干细胞，然后悬浮振荡培养12-20天，得到长春花干细胞系。

9.根据权利要求8所述的离体培养方法，其特征在于：得到长春花干细胞系之后，按接种量40-60g/L接种到8-10L MS液体培养基中，悬浮培养12-20天。

10.根据权利要求8或9所述的离体培养方法，其特征在于：悬浮培养条件为：温度20-30℃，转速100-120rpm，完全暗培养，通气比0.25～0.50vvm；所述的MS液体培养基添加有25-35g/L蔗糖、2.0-4.0mg/L NAA和2.0-3.0mg/L 2,4-D，pH值5.6-5.8。