[发明专利]对松墨天牛等墨天牛属昆虫具有毒力的Bt毒素

说明书

本发明涉及生物防治领域，具体涉及一种对松墨天牛等墨天牛属昆虫具有毒力的Bt毒素。所述Bt毒素为毒素BRC1912，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该毒素对松墨天牛等墨天牛属昆虫具有良好的杀虫活性，本发明为松墨天牛等墨天牛属的害虫防控提供了有效途径。

技术领域

本发明涉及林业害虫的生物防治领域，具体涉及一种对松墨天牛等墨天牛属昆虫具有毒力的Bt毒素。

背景技术

在林业上，鞘翅目天牛科墨天牛属昆虫是松材线虫的主要传播媒介（Mota etal., 2008; Futai, 2013），也是主要的蛀干害虫，又被称为次期性害虫，生活在韧皮部或者木质部之中。在韧皮部啃食输导组织，阻止树木对养分的吸收，在木质部啃食边材，对水分的运输造成阻碍，不严重的会造成树木发育不良，严重的导致树木整株坏死。蛀干害虫由于其生活习性，除了成虫会在树外活动，其它虫态几乎都生活在树木的韧皮部或者是木质部中，极其隐蔽，也较难防治。鉴于当前的防治方法效果不佳，其中生物防治具有绿色环保，持效期长的优点，进一步寻找有效的微生物制剂对松墨天牛等墨天牛属昆虫进行生物防治，对于遏制松材线虫病的扩散蔓延具有重要的意义。

苏云金芽胞杆菌（简称Bt）是一种昆虫病原微生物，对16个目3000多种害虫有活性，被广泛地应用于农、林和卫生害虫的生物防治中（Adang et al.，2014）。Bt的杀虫活性主要依赖于其在芽胞期产生的伴孢晶体蛋白（简称ICPs），主要是Cry毒素（Deist et al.,2014）。不同类别的Cry毒素的杀虫谱表现出显著的特异性，如Cry1、Cry9、Cry15类毒素对鳞翅目昆虫有效，Cry3、Cry7、Cry8和Cry34/35类毒素对鞘翅目的幼虫有活性（Bravo, 1997）。其中，有报道表明，Cry3A类毒素对天牛科幼虫有效，但其杀虫活性不高（Chen et al.,2005）。因此，为有效防治天牛科墨天牛属昆虫，迫切需要解决Cry3A毒素对其弱毒的问题。

在Cry3Aa毒素作用过程中，当其被昆虫摄取后，原毒素会被昆虫肠道蛋白酶酶解活化出55 kDa大小的活性片段，该片段对鞘翅目昆虫表现出杀虫活性（Walter et al.,2008; Li et al., 2011）。然后，单体的活性毒素寡聚化形成的低聚物与中肠上皮细胞刷状缘膜囊泡（BBNV）上的受体结合，从而引起膜穿孔并导致细胞死亡（Pardo-López et al.,2013）。而有研究表明，天牛肠道蛋白酶主要为胰蛋白酶，然而，73 kDa Cry3Aa毒素无法被天牛的肠道蛋白酶有效酶解活化出55 kDa的活性片段，即存在酶解活化障碍。已有研究证明Cry3Aa原毒素domain I的α-helix 3和α-helix 4之间的loop区域是被蛋白酶切割释放活性片段的区域，而在该区域缺乏胰蛋白酶的识别位点（Oppert et al., 1997）。此外，还发现55 kDa的Cry3Aa活性片段很容易被胰蛋白酶过度酶解为较小短肽，从而使得毒素对天牛失去活性。这表明在Cry3Aa毒素的其他结构域中存在较多的能够被胰蛋白酶识别的位点，从而使得毒素被过度酶解。这些结果表明昆虫肠道蛋白酶对Cry3A毒素的酶解活化障碍和过度酶解是造成其对目标昆虫弱毒的主要原因。因此，为解决昆虫肠道蛋白酶对毒素的酶解活化障碍和过度酶解现象，本发明以cry3Aa2基因为对象，通过分子改造的手段对毒素中的胰蛋白酶识别位点进行突变，开发能够产生对墨天牛属昆虫具有毒力的新型Cry毒素，是一项具有重大意义和应用价值的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种对松墨天牛等墨天牛属昆虫具有毒力的Bt毒素，以SEQ ID NO.4（Cry3Aa2）为支架毒素蛋白，通过分子改造的手段对毒素中的胰蛋白酶识别位点进行突变，开发能够产生对墨天牛属昆虫具有毒力的新型Cry毒素。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

对墨天牛属昆虫具有毒力的Bt毒素，所述Bt毒素为毒素BRC1912蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。