[发明专利]一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒及其应用

说明书

一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒及其应用，所述试剂盒含有：（a）一抗：GPC3单克隆抗体工作液，所述GPC3单克隆抗体为鼠源GPC3抗体或人源GPC3抗体；（b）二抗：HRP标记羊抗鼠IgG抗体工作液；（c）DAB显色液A缓冲液和DAB显色液B缓冲液；（d）苏木素细胞染色液；（e）组织抗原修复液；（f）2‑3％体积比的H₂O₂；本发明涉及的检测试剂盒具有高灵敏性，高特异性和高准确性的特点，不仅可以区分癌变组织和正常组织，还可以区分癌变组织中癌变的细胞和正常的细胞；GPC3在正常肝细胞中呈阴性表达染色，而在癌变细胞细胞浆和细胞膜中呈阳性表达，有效地区分肝癌变细胞和正常细胞，为临床的诊断和治疗提供参考依据。

技术领域

本发明涉及分子生物学、医学免疫学与体外血清学诊断技术领域，具体地说涉及一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒及其应用，通过建立可以用于临床病理诊断的试剂盒，来验证该抗体的临床适用性。

背景技术

肝细胞癌(hepatocellular Carcinoma，HCC)是目前全世界发病率很高的第五大癌症，我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％。目前外科手术切除肿瘤仍是治疗HCC最好、最快捷的方法。然而，大多数患者就诊时已失去了最佳治疗时机，能够早期手术切除者只占10-20％，即使手术切除，复发率仍很高。所以早期发现、早期诊断、早期治疗HCC是提高患者生存率的关键，也是预后和治疗的关键。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)，其基因位于人染色体X26q1,长900kb，GPC3开放阅读框有1740bp,编码580个氨基酸，分子量为66kD。GPC3基因编码的蛋白属于硫酸已酰肝素蛋白聚糖(Heparan Sulfate Proteoglycans，HSPGs)，通过糖基磷脂酰蛋白(glycosyl-phosphatidylinositol Anchor,CPI)锚定在细胞表面，可结合生长因子等，调控着细胞生长、繁殖、分化、黏附和迁移等行为。

研究证实GPC3蛋白在肝癌组织中高表达，而在非癌组织中没有表达或表达极少，并能在血清中检测到GPC3的含量，用免疫组化的方法检测肝癌患者的GPC3阳性率在90％以上，而其他良性肝病和正常肝组织中表达率为极低，其特异性能达到96％以上。另外，GPC3在对于HCC在血清中的检出率明显高于AFP，两者分别是76.3％和31.3％。因此，GPC3对HCC的诊断率明显高于AFP，尤其在AFP阴性的早期肝癌的诊断中发挥重要作用。

GPC3作为一种新的生物学指标，目前临床上暂时没有针对其的检测方法，在监测肿瘤的发生发展中的应用还属空白，而之所以这个空白很难突破，在于GPC3蛋白很难通过体外重组方式进行表达，更会影响抗体的制备，我们构建了可以稳定表达GPC3蛋白的细胞系，用该细胞系表达的蛋白进行免疫小鼠，筛选制备出可以表达效价较高的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。由于杂交瘤细胞有丢失高特异性高活性的风险，或者细胞状态不好乃至死亡。而经过杂交瘤测序，可以获得相应的序列，可以以重组蛋白的方式来稳定获得抗体；从而使得研发或生产者不必以杂交瘤细胞为载体保留该抗体，而可以以碱基序列的形式进行保存和传播交流、鉴定。我们将该GPC3单克隆抗体克隆株进行测序处理加工修饰后，再通过构建的人源化抗体重组表达载体，在公司验证的稳定细胞系进行抗体的大量表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒及其应用，要解决现有技术肝癌诊断不灵敏的技术问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：

(a)一抗：GPC3单克隆抗体工作液，所述GPC3单克隆抗体为鼠源GPC3抗体或人源GPC3抗体，两种抗体皆为本实验室制备；

(b)二抗：HRP标记羊抗鼠IgG抗体工作液；