[发明专利]一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：

（a）一抗：GPC3单克隆抗体工作液，所述GPC3单克隆抗体为鼠源GPC3抗体或人源GPC3抗体；

（b）二抗：HRP标记羊抗鼠IgG抗体工作液；

（c）DAB显色液A缓冲液和DAB显色液B缓冲液；

（d）苏木素细胞染色液；

（e）组织抗原修复液；

（f）2-3％体积比的H₂O₂。

2.如权利要求1所述的一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒，其特征在于，所述鼠源GPC3抗体的制备方法包括如下步骤：

(a)动物免疫：通过亲和层析和离子交换层对GPC3蛋白进行纯化后，浓缩至5mg/ml，将GPC3蛋白抗原与弗氏佐剂等体积混合乳化后于0天、14天、28天、35天背部皮下多点免疫BALb/c小鼠，0.2mg/只，0天免疫为弗氏完全佐剂，末次免疫一周后采血，通过间接ELISA检测抗体效价，末次免疫一周后采用乙肝疫苗原液腹腔冲击选定的小鼠即为备用融合小鼠；

（b）细胞融合：复苏培养SP2/0细胞株，融合前3天扩大培养，融合前1天去除RPMI1640细胞培养液，重新添加培养液，取步骤（a）中选用的备用融合小鼠的脾细胞制备小鼠脾细胞悬浮液和本实验室保存的SP2/0细胞进行融合；

（c）单克隆抗体的大量制备：ELISA法测定上清液选取阳性高的孔，将阳性孔细胞转入24孔板进行扩大培养，并及时进行亚克隆经3次亚克隆得到稳定分泌抗体的细胞系；获得细胞免疫小鼠的腹水，纯化后得到GPC3单克隆抗体。

3.如权利要求2所述的一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒，其特征在于，所述动物免疫具体包括：GPC3蛋白纯化后，监测波长为280nm，收集洗脱峰，取少量洗脱蛋白液做电泳分析，其余用0.85%的NaCl溶液在4℃透析48h，之后用超滤膜浓缩至5mg/ml，将磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白抗原与弗氏佐剂等体积混合乳化后于0天、14天、28天、35天背部皮下多点免疫Balb/c小鼠，0.2mg/只，末次免疫一周后采血，间接ELISA检测血清中抗体效价，血清稀释104倍时OD值为1.089,于末次免疫一周后采用乙肝疫苗原液腹腔冲击选定的小鼠，3天后取小鼠脾脏，进行细胞融合。

4.如权利要求2所述的一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒，其特征在于，所述细胞融合具体包括：

复苏SP2/0细胞株和准备小鼠脾细胞悬液：细胞融合前复苏培养SP2/0细胞株，融合前3天扩大培养，融合前1天去除RPMI1640细胞培养液，重新添加培养液，SP2/0细胞准备完成；处死免疫小鼠，按常规方法制备小鼠脾细胞悬液；

细胞混匀准备：脾细胞与SP2/0细胞计数结果分别加入适量不完全IMDM培养液，SP2/0细胞晃动混匀，脾细胞用移液管吹打均匀，然后将脾细胞与SP2/0细胞按1:2合于50ml离心管中，混匀，再加不完全MDM培养液至50ml，离心5钟，倒净上清，轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，离心管置37°C水浴，准备融合；

细胞融合：将37°C预热的50%的PEG4000lml，用滴管缓慢滴入混合细胞管，边滴边转动离心管，使细胞保存在混匀状态，静置90s后立即缓慢加入15ml37°C无血清的MDM培养基，然后离心5钟，弃去上清，再加入MDM完全培养液，混勾，将混悬液分别加至96孔细胞培养板中，100ul/孔，于37°C培养箱内培养，次日细胞板加HAT培养液100ul/孔，每3天换一次HAT培养液，观察是否出现杂交瘤，两周后换HT培养基，观察融合细胞生长状况。

5.如权利要求1~4任意一项所述的一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒的应用，其特征在于，用于临床肝癌诊断。