[发明专利]一种多功能3D重组皮肤模型的低温保存方法

说明书

本发明公开了一种多功能3D重组皮肤模型的低温保存方法，本发明首次将细胞松弛素B应用于皮肤模型的固体保存中，采用三步法进行处理，该处理方法可以维持模型在运输过程中的细胞活性，减少细胞缺氧性损伤，以保证3D重皮肤组模型测试的准确性和细胞的活力，并极大程度延长保存时间。

技术领域

本发明涉及一种多功能3D重组皮肤模型的低温保存方法，属于生物医学领域。

背景技术

随着体外器官培养基体外替代技术的发展，基于3D体外细胞培养构建的3D重组皮肤模型在刺激性试验安全性及有效性评价方面表现出特有的趋势。体外构建的3D表皮模型类似于人体皮肤结构，可以用于化妆品检测的体外替代试验；体外构建的3D全层皮肤是具有活细胞的组织工程皮肤，具有表皮层和真皮层，可以参与创面与伤口的修复，可用于由多种原因引起的皮肤缺损的修复，加快皮肤创伤的愈合，并形成功能性的皮肤，以此来减轻患者疼痛，提高患者的生活质量。

但是，由于体外3D重组皮肤模型的特点，要求模型具有稳定性，并且在长距离运输过程中能够很好的保持其原有的特性，以期能够测试并检验出化学物质或其他因素对其影响，从而得到准确的结果。而全层皮肤用于临床上也需要克服异地运输的困难，以保证运输后的皮肤具有一定的活性，从而确保临床应用的效果。目前关于适用于低温保存运输皮肤模型及组织工程皮肤的固体培养基已有相关报道(如中国专利201410418456.X，201510697694.3，201510697887.9)，但目前固体保存仍有较大局限性，其保存时间仍为限制性因素。

细胞松弛素B具有多种生物学功能，尤其是对于微丝结构的影响，它作为冷冻保护剂，可以增加细胞骨架弹性，这对于我们进行低温保存而言至关重要，目前已有中国专利201410418456.X将细胞松弛素B添加于保存液中，但迄今为止，已报道的文献中关于细胞松弛素B的利用均发生在液体环境中，并且剂量添加和处理时间长短的差异对细胞或组织都会产生巨大影响。由于固体保存较液体保存溶液流动性差，许多分子运动受限，致使物质交换能力降低，这在很大程度上限制了固体保存时限的延长。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种多功能3D重组皮肤模型的低温保存方法，本发明首次将细胞松弛素B应用于皮肤模型的固体保存中，该处理方法可以维持模型在运输过程中的细胞活性，减少细胞缺氧性损伤，以保证3D重皮肤组模型测试的准确性和细胞的活力，并极大程度延长保存时间。

一种多功能3D重组皮肤模型的低温保存方法，包括如下步骤：

1)利用细胞培养技术培养3D重组皮肤模型；

2)在步骤1)培养的3D重组皮肤模型处于培养末期时更换细胞培养液，换液后在培养液中添加细胞松弛素B，添加的细胞松弛素B在培养液中的终浓度为0.1-5ug/ml，37℃处理1-24h；

3)将经过步骤2)处理的3D重组皮肤模型置于改良的液体保存液中，4℃预冷0.5h-12h；

4)配制改良的固体培养基，将获得的固体培养基加入经过步骤3)处理过的3D重组皮肤模型外部，凝固后放入无菌包装袋中封口。

进一步的，上述步骤2)中所述的细胞培养液是以基础培养基为主体添加生长因子的培养液；

所述基础培养基为DMEM、F12或DMEM和F12复配的混合液，所述DMEM和F12复配的混合液中DMEM和F12体积比为4:1-12。

所述生长因子包括氢化可的松、腺嘌呤、ITT、L-谷氨酰胺、EOP(乙醇胺和催化磷脂酰乙醇胺)、人表皮生长因子(hEGF)、牛垂体提取物(BPE)、硒、胎牛血清。