[发明专利]一种多功能3D重组皮肤模型的低温保存方法

权利要求书

1.一种多功能3D重组皮肤模型的低温保存方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)利用细胞培养技术培养3D重组皮肤模型；

2)在步骤1)培养的3D重组皮肤模型处于培养末期时更换细胞培养液，换液后在培养液中添加细胞松弛素B，添加的细胞松弛素B在培养液中的终浓度为0.1-5ug/ml，37℃处理1-24h；

3)将经过步骤2)处理的3D重组皮肤模型置于改良的液体保存液中，4℃预冷0.5h-12h；

4)配制改良的固体培养基，将获得的固体培养基加入经过步骤3)处理过的3D重组皮肤模型外部，凝固后放入无菌包装袋中封口，所述的改良的固体培养基由琼脂糖溶液与改良的液体保存液按照体积比1:1混合均匀后凝固而成；

步骤3)中所述的改良的液体保存液的制备方法包括如下步骤：

S1配制细胞培养液；

S2在步骤S1获得的细胞培养液中添加细胞松弛素B、海藻糖、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、维生素C、维生素E、透明质酸、硫酸软骨素、去铁胺、1,6-二磷酸果糖，即可获得改良的液体保存液。

2.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于，步骤2)中所述的细胞培养液是以基础培养基为主体添加生长因子的培养液；

所述基础培养基为DMEM、F12或DMEM和F12复配的混合液，所述DMEM和F12复配的混合液中DMEM和F12体积比为4:1-12；

所述生长因子包括氢化可的松、腺嘌呤、ITT、L-谷氨酰胺、EOP、人表皮生长因子、牛垂体提取物、硒、胎牛血清。

3.如权利要求2所述的保存方法，其特征在于，所述氢化可的松在基础培养基中的终浓度为0.1～2ug/ml、所述腺嘌呤在基础培养基中的终浓度为10～30mM、所述ITT在基础培养基中的终浓度为5.0～10.0ug/ml，所述L-谷氨酰胺的浓度为30～60mM，所述EOP在基础培养基中的终浓度为1～10mM，所述人表皮生长因子在基础培养基中的终浓度为0.1～1ng/ml，所述硒在基础培养基中的终浓度为10^-3～0.1nM，所述牛垂体提取物在基础培养基中的终浓度为0.1～2ug/ml，所述胎牛血清在基础培养基中的体积分数为2～10％。

4.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于，步骤S2中所述细胞松弛素B在液体保存液中的终浓度1-2ug/ml，所述海藻糖在液体保存液中的终浓度为1～20mM，所述蔗糖在液体保存液中的终浓度为50～100mM，所述甘氨酸在液体保存液中的终浓度为1～20mM，所述丙氨酸在液体保存液中的终浓度为1～10mM，所述腺苷在液体保存液中的终浓度为1～10mM，所述维生素E在液体保存液中的终浓度为10mM～30mM，所述维生素C在液体保存液中的终浓度为10mM～40mM，所述去铁胺在液体保存液中的终浓度为1mM～10mM，所述1,6-二磷酸果糖在液体保存液中的终浓度为1～15mM、所述透明质酸在液体保存液中的体积分数为0.01～1％、所述硫酸软骨素在液体保存液中的终浓度为0.5～2g/L。

5.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述琼脂糖溶液的浓度为0.25％～5％，所述琼脂糖为低熔点琼脂糖，熔点为60～70℃，凝固温度为28℃～32℃。