[发明专利]一种单细胞遗传转化方法及其应用

说明书

本发明涉及一种单细胞遗传转化方法及其应用。本发明人提供了优化的方法以制备木本植物悬浮细胞，所述悬浮细胞具有再生分化能力强、目的基因转化率高等特点。本发明还基于该悬浮细胞建立了高效遗传转化系统。本发明的方法和系统有利于实现高通量且高效的目的基因转化、编辑操作。

技术领域

本发明属于植物学和分子生物学领域，更具体地，本发明涉及一种单细胞遗传转化方法及其应用。

背景技术

木本植物如杨树等转基因遗传操作主要采用农杆菌介导的叶盘转化法(如Fillatti，J.J.等，MolecularGeneral Genetics 206，192-199；Movahedi，A等(2014)，Anefficient Agrobacterium-mediated transformation system for poplar.Int J MolSci 15，10780-10793)。叶盘法的做法一般是利用农杆菌感染叶片外植体并短期共培养，更具体的步骤例如：先将实验材料的叶子表面进行消毒，再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片，即叶盘；为了对叶盘进行接种处理，将它放在土壤农杆菌培养液中浸泡4～5min，然后用滤纸吸干，放在看护培养基上进行培养；叶盘在看护培养基上培养两天后，转移到含有适当抗生素的选择培养基上进行培养；经过数周后，叶盘周围会长出愈伤组织并分化出幼苗；对这些幼苗的进一步检测可以确定它们是否含外源基因以及外源基因的表达情况。

叶盘转化法对转化叶片要求很高(因为不同部位叶片遗传转化效率存在很大差别)，单棵苗中可用于转化的叶片有限。同时，叶片切割及伤处理费时费力，从而限制规模化遗传转化工作的开展。近年来，利用植物悬浮细胞进行植物生理、生化和遗传修饰以及寄主和寄生物的相互作用的研究日益增多，遗传育种工作者们还把悬浮单细胞用于诱变、筛选和创造新类型的研究。尽管前人在杨树悬浮细胞诱导、遗传转化体系建立方面开展了一些工作，但是其悬浮细胞均来自于愈伤组织再培养，产生的悬浮细胞系易结块形成新的愈伤组织，影响细胞培养和转化。直接用叶片组织大量制备悬浮单细胞国内外报道很少。分离少数草木植物细胞和原生质体所采用的酶解法不能直接用于木本植物，酶解法分离的细胞或是破碎的，或是完全不能分离出来；用机械研磨法分离，所得完整单细胞数量很少，而且难以纯化，没有实用意义。

因此，建立木本植物如杨树的高效、稳定的悬浮细胞诱导和遗传转化体系是林木基础研究和林业产业发展的重要技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单细胞遗传转化方法及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种单细胞遗传转化方法，包括：

(1)从木本植物的组织获取悬浮细胞，包括将植物组织块在持续光照条件下进行振荡培养，获得悬浮细胞；

(2)将步骤(1)的悬浮细胞与含有待遗传转化目的基因的转化菌混合培养，之后除去转化菌；

(3)继续培养步骤(2)的悬浮细胞，筛选发生重组转化的细胞。

在一个优选例中，所述遗传转化包括：将外源的目的基因转化入植物中。

在另一优选例中，(1)中，所述的持续光照条件为：每天光照超过20小时；较佳地超过22小时，如每天24小时光照。

在另一优选例中，(1)中，光照强度1000～3000Lux；较佳地1500～2500Lux；更佳地1800～2200Lux。

在另一优选例中，(1)中，在含有生长素或生长素类似物的MS培养基中培养；较佳地，所述的生长素或生长素类似物包括：2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。

在另一优选例中，所述的2,4-二氯苯氧乙酸在培养基中的浓度为1.8～2.8mg/L；较佳地2～2.7mg/L；更佳地2.4～2.6mg/L。