[发明专利]FACS-Ichip原位培养微生物装置及培养方法

说明书

本发明公开了一种FACS‑Ichip原位培养微生物装置，还提供了使用FACS‑Ichip技术挖掘土壤微生物“暗物质”的方法，包括如下步骤：1)、FACS‑Ichip原位培养微生物装置的制作：将培养孔的底部打穿形成通孔，作为培养仓；在培养板的反面设置下膜；2)、将采集的微生物样品制备成微生物悬浊液；3)、微生物分选、FACS‑Ichip封装：利用流式细胞仪通过FACS技术将活性单细胞分选至每个培养仓中，并向培养仓内加入培养基；在培养板的正面设置上膜，从而形成FACS‑Ichip；4)、原位培养；5)、菌落富集与纯化。本发明涉及的FACS‑Ichip方法确保培养板的每个培养仓中只含有一个细胞。

技术领域

本发明属于微生物领域；具体涉及一种FACS(fluorescence activated cellsorting，流式细胞荧光分选)-Ichip(isolation chip，隔离芯片)原位培养微生物装置及培养方法。

背景技术

微生物是土壤中最为丰富的生命形式，其种类与数量远远超过其他物种，是土壤生态系统重要的组成部分。土壤是微生物的天然培养基，蕴含微生物生长所需的各种因子。土壤微生物通过矿化和固定作用维持土壤养分周转，参与物质转化与能量传递等过程(Falkowski等, Science(New York,N.Y.),2008,320(5879):1034-9)，对研究土壤具有重要意义。

目前研究仅仅揭示了土壤微生物的一小部分，绝大多数微生物对于我们是未知的，此前对微生物的研究主要基于传统培养基培养与分子技术相结合，这种传统方法仅能恢复1％～5％的微生物种群，在土壤生态系统中，该数值甚至可能低于1％(Pham等,Trendsin Biotechnology, 2012,30(9):475-484)。传统的培养手段是通过含有特定营养物质的培养基与人工控制环境因素来模拟微生物生长的自然环境而得到微生物群落，但由于自然条件下影响微生物生长的因素过多，我们无法还原其生长的自然环境下的各种条件，从而只有很少的一部分微生物被培养出来。未能实现培养的微生物种被定义为土壤微生物“暗物质”。

随着现代分子生物学的发展，在一定程度上补充了土壤微生物群落水平的生理信息特征，但分子组学技术仅能帮助我们探究微生物多样性，不能直接得到微生物种质资源，因此基于培养的方法仍有助于我们研究土壤微生物的生理特征及代谢过程，探究其对土壤发挥的作用与功能。探究微生物多样性对基础科学和应用科学都具有重要意义，固有传统方法的缺陷使大部分微生物无法培养出来，因此迫切需要对传统培养方法进行创新。

一种名为ichip(Nichols等,Applied and Environmental Microbiology,2010,76:2445-2450) 的原位方法应运而生，它由多孔中央板及两侧膜组成，膜孔径足以大到使环境中的营养物质进入并足够小到防止细胞移出。使用时将中央板浸入含有微生物细胞的稀释混合液中使每孔平均含有一个细胞，并以两块侧板及螺丝将中央版和膜固定，形成一个密封结构并将整个装置放入环境中培养。数据表明，使用此方法可以在海水中达到40％、土壤中达到50％的培养恢复率，是传统培养方法的5倍(Berdy等,Nature Protocols,2017,12:2232-2242)。

然而，上述方法所应用的稀释微生物悬浊液并不能保证每孔只含有一个微生物细胞，孔中可能含有多个或不含有细胞，不利于单细胞培养，其迫切需要创新。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供能实现精准单细胞培养的FACS-Ichip原位培养装置及培养方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种FACS-Ichip原位培养微生物装置，包括带有培养孔的培养板：

将培养孔的底部打穿形成通孔，作为培养仓；

在培养板的反面设置下膜，在培养板的正面设置上膜；

所述下膜能密封的覆盖住所有的培养孔的底部；