[发明专利]一种水稻愈伤组织的超低温保存方法

说明书

本发明涉及一种水稻愈伤组织的超低温保存方法；包括挑选健康成熟的水稻种子，消毒灭菌后接种到含有3mg/L 2,4‑D的NB培养基上诱导长出初生愈伤组织，再转接到含有2mg/L 2,4‑D的NB培养基上继代增殖，扩繁后的愈伤用筛网筛选出胚性愈伤颗粒，转入含有100g/L蔗糖和2mg/L 2,4‑D的NB培养基上预培养，预培养后的愈伤直接进行超低温冻存。解冻时从液氮中取出冻存管，立即放入39‑41℃水浴中快速解冻2‑4min，然后将愈伤接种到含有2mg/L 2,4‑D的NB培养基上恢复培养，待新生愈伤长出后，挑取新生愈伤进行分化培养至绿苗长出。本发明的水稻愈伤超低温保存方法简便易行，稳定可靠，且超低温保存后愈伤存活率高，分化成苗率高。

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，涉及一种植物超低温保存方法，具体涉及一种水稻愈伤组织的超低温保存方法。

背景技术

水稻是全球最主要的三大粮食作物之一，也是亚洲最主要的粮食作物。丰富的水稻遗传资源和不断改良的优良水稻品种，保障了全球约半数人口的粮食需求。但随着现代人类急速扩张的经济活动，全球工业化背景下迅速恶化的自然环境及不利的气候条件，导致了水稻种植面积日益减少，水稻产量受到影响；同时机械化规模化种植方式的推广，以产量为主导的育种策略，使得应用的水稻品种越来越单一化，资源的遗传基础变得狭窄，遗传多样性逐渐丧失，原来自然资源中的抗虫抗病耐旱耐淹等抗逆基因渐渐被丢失。因此当前形势下对水稻种质资源遗传多样性的保护已刻不容缓。

目前，我国对水稻种质资源的保存方式主要以种子保存的种质库为主，但低温种质库建设成本高，运行维护费用高昂，有条件有能力建设的种质库单位还很少。随着生物技术的发展，植物组织与细胞的培养为植物种质保存开辟了新的途径，组织培养物能快速大量繁殖,再生植株可保持原有的遗传特性。而超低温保存(-196℃)条件下，植物的生物化学活性近乎停止，贮藏过程中的生理和遗传变化能够控制在最低限度内，避免了遗传性状变异或污染的危险，被认为是植物遗传资源长期保存的最优选择。

开展植物超低温保存研究以来，超低温保存技术和保存效率上不断提升，超低温保存的植物种类也在不断地增长，但多数应用在苹果、樱桃、柑桔、香蕉、木薯等木本植物以及马铃薯、红薯、草莓等经济植物上。水稻的超低温保存最早开始于1979年Sala等报道的水稻悬浮细胞的超低温保存，此后相关研究也多集中在利用悬浮细胞系的作为超低温保存材料。一直以来对水稻种质资源的超低温保存研究很少，除悬浮细胞外的保存材料也寥寥无几，仅1996年殷晓辉教授通过程序降温仪对野生稻愈伤进行超低温保存研究，获得冻后再生植株。2000年章志宏教授等采用程序降温法对水稻幼穗离体培养诱导的不定芽进行超低温保存，得到再生植株。2016年上海市农业生物基因中心林田等用茎尖玻璃化的方法保存了普通野生稻种质资源。但上述保存方法往往步骤较繁琐，对设备要求(如程序降温仪)或材料要求(如茎尖、幼穗等材料细小幼嫩，取材操作难度大)都比较高，不利于推广应用，因此探索易获取易繁殖的组织材料，建立更简便高效低成本的水稻超低温保存方法是亟需和必要的。

发明内容

现有的水稻超低温保存方法对设备要求和操作技术要求高，且过程较繁琐，污染几率大，不利于广泛应用。本发明的目的是提供一种简便高效，成本低廉的水稻愈伤组织的超低温保存方法，为水稻种质资源的长期安全保存提供了一条适用广效率高的途径，也对其他禾本科植物的超低温保存方法有一定指导意义。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供了一种水稻愈伤组织的超低温保存方法，包括如下步骤：

步骤A1：取健康成熟的水稻种子，消毒灭菌后接种到含有2-3mg/L 2,4-D的NB培养基上诱导初生愈伤组织；

步骤A2：挑取初生愈伤组织，转接到含有2mg/L 2,4-D的NB培养基上进行继代增殖培养；

步骤A3：增殖扩繁后的愈伤组织，用筛网筛选出特定大小的愈伤颗粒，转入含有100g/L蔗糖或麦芽糖、和2mg/L 2,4-D的NB培养基上预培养7-10天；