[发明专利]一种水稻愈伤组织的超低温保存方法

权利要求书

1.一种水稻愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，所述保存方法由以下步骤组成：

步骤A1：取健康成熟的水稻种子，消毒灭菌后接种到含有2-3mg/L 2,4-D的NB培养基上诱导初生愈伤组织；

步骤A2：挑取初生愈伤组织，转接到含有2mg/L 2,4-D的NB培养基上进行继代增殖培养；

步骤A3：增殖扩繁后的愈伤组织，用筛网筛选出特定大小的愈伤颗粒，转入含有100g/L蔗糖和2mg/L 2,4-D的NB培养基上预培养7-10天；

步骤A4：将预培养后的愈伤组织直接装入冻存管，每支冻存管装载量不超过1/2，然后迅速投入液氮中保存；

NB培养基为1L培养基中含有463mg (NH₄)₂· SO₄, 125.33mg CaCl₂, 90.37mg MgSO₄,400mg KH₂PO₄, 2830mg KNO₃, 3mg H₃BO₃, 0.025mg CoCl₂·6H₂O, 0.025 CuSO4·5H₂O,27.8mg FeSO₄·7H₂O, 37.26mg Na₂-EDTA·2H₂O, 10mg MnSO₄·H₂O, 0.25mgNa₂NoO₄.2H₂O, 0.75mg KI, 2mg ZnSO₄·7H₂O, 100mg肌醇，1mg 烟酸, 1mg 盐酸吡哆醇,10mg烟酸硫胺素, 30g蔗糖，7g琼脂粉，余量为水，调整pH值为5.9；

步骤A3中，用筛网筛选出直径1.5-3mm大小的胚性愈伤颗粒进行预培养；所述预培养的条件为26-28℃暗培养；

所述方法超低温保存后的水稻愈伤组织的恢复培养方法包括如下步骤：

步骤B1：从液氮中取出冻存管，立即放入39-41℃水浴中快速解冻2-4min；

步骤B2：将解冻后的愈伤接种到含有2mg/L 2,4-D的NB培养基上恢复培养10-14天，恢复培养条件为28-30℃暗培养，直至新生愈伤长出；所述恢复培养前在超净台工作中将冻存管里解冻的愈伤组织转到无菌滤纸上，自然风干8～12min，再转接到恢复培养基上进行恢复培养。

2.根据权利要求1所述的水稻愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，步骤A1中，诱导培养条件为30℃，光照12h/天，光照强度1000-1200lux。

3.根据权利要求1所述的水稻愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，步骤A2中，继代增殖培养条件为26-28℃暗培养。

4.根据权利要求1所述的水稻愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，利用不同目数的筛网，筛选出偏圆粒状、浅黄色，质地致密，1.5-3mm大小的胚性愈伤颗粒。

5.一种水稻愈伤组织超低温保存后分化成苗的培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：第一步按照权利要求1所述方法进行水稻愈伤组织的超低温保存, 第二步挑取如权利要求1所述方法恢复培养后长出的新生愈伤组织，转入含有2.0mg/L 6-BA, 2.0mg/LKT , 0.2mg/L IAA 和0.2mg/L NAA的MS培养基上进行分化培养，培养20-30天分化出绿苗。

6.根据权利要求5所述的水稻愈伤组织超低温保存后分化成苗的培养方法，其特征在于，分化培养条件为25℃，光照12h/天，光照强度4000-5000lux。