[发明专利]集成循环肿瘤细胞分离及单细胞免疫印迹的微流控芯片

说明书

本发明公开了一种集成循环肿瘤细胞分离及单细胞免疫印迹的微流控芯片，其特征在于，包括循环肿瘤细胞分选单元、单细胞捕获单元、光活性凝胶电泳分离单元和免疫印迹分析单元，循环肿瘤细胞分选单元将循环肿瘤细胞分离分选出来，单细胞捕获单元将分选富集后的细胞实现单细胞的捕获并对细胞进行封闭裂解，光活性凝胶电泳分离单元将细胞裂解后的蛋白推进到芯片上的凝胶涂层区域，免疫印迹分析单元通过特异性的抗体孵育和洗脱，对靶蛋白分子进行荧光或发光基团标记并检测其信号。在微流控芯片上集成循环肿瘤细胞的细胞分选、纯化、单细胞捕获、凝胶电泳与免疫印迹分析等多种功能单元，极大提高对循环肿瘤细胞的分离速度、分析速度和自动化程度。

技术领域

本发明涉及循环肿瘤细胞分离及蛋白质分析芯片领域，尤其涉及一种集成无标记高通量循环肿瘤细胞分离及单循环肿瘤细胞免疫印迹的微流控芯片。

背景技术

循环肿瘤细胞(CTC)

随着人们生活质量的提高、寿命的延长，与癌症相关的死亡率在过去几十年稳步增加，癌症已成为人类的头号杀手。世界卫生组织进行的一项研究发现，如果癌症患者在转移性癌症发生前诊断并治疗，至少30％的死亡率是可以预防的，而导致肿瘤随着血液循环系统发生远位转移并导致患者死亡的主要罪魁祸首之一正是血液中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTC)⁽¹⁾。CTC是指由自发或因诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，侵入血液循环的肿瘤细胞⁽²⁾。大部分CTC再进入外周血后发生凋亡或被吞噬。少数CTC能逃避机体免疫，在原发或远处脏器驻留，从而形成复发、转移病灶。循环肿瘤细胞是近30年来研究应用的仅有的几个新型肿瘤分子标志物之一。通过检测CTC数量和蛋白表达可对肿瘤进行确诊⁽³⁾、判断预后^(4,5)、监控疗效⁽⁶⁾。例如，当CTC出现上皮间质转换(EMT)、过表达上皮细胞粘附分子往往提示肿瘤患者预后不佳；通过对比手术或放化疗前后血液中CTC数量，可以判断治疗是否有效，具有重要的临床研究及应用价值。

循环肿瘤细胞的异质性

细胞的异质性(heterogeneity)是一个普遍存在的生物学现象，在干细胞分化、胚胎发育、肿瘤形成、药物功效和免疫反应等细胞生理过程中常常被观察到⁽⁷⁾。即使表观看起来相同的细胞，也可能存在着显著的异质性。在循环肿瘤细胞的研究领域，科研人员也逐渐认识到解决细胞异质性的问题是研究成果临床转化研究的关键。循环肿瘤细胞和散播肿瘤细胞(DTCs)被认为是引起肿瘤远处转移的“种子”，对于CTCs与 DTCs异质性、EMT动态调控、高转移潜能亚群的研究是目前热点之一。

大量研究表明，CTC以不同形态存在于外周血中，既有游离的单个CTC，也有聚集成团的细胞团。且肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中会发生不同程度的上皮-间质转换⁽⁸⁾，故CTC存在不同的类型，包括上皮细胞表型、间质细胞表型和上皮细胞与间质细胞混合表型。2019年6月20日，Science Advances在线发表了上海市第一人民医院王红霞团队的研究成果“Epithelial-type systemic breast carcinoma cells with arestrictedmesenchymal transition are a major source of metastasis”。研究⁽⁹⁾表明肿瘤细胞EMT并非“全”或“无”的过程，更多肿瘤细胞处于EMT中间状态，呈现异质性特点；与间充质表型细胞(M，M/E)相比，以上皮细胞表型(E和E/M)为主细胞亚型具有更强的转移潜能；EPCAM+CTCs和DTCs与远处转移及预后差显著相关。研究从形态学、分子和表型分析揭示了CTCs的EMT异质性，证实了CTCs上皮和间充质特征共存的特点。除此以外，肿瘤细胞本身具有高度异质性。肿瘤异质性作为肿瘤特征之一，是肿瘤恶性生长、侵袭转移、药物敏感性、预后等差异的根源。