[发明专利]集成循环肿瘤细胞分离及单细胞免疫印迹的微流控芯片

权利要求书

1.一种集成循环肿瘤细胞分离及单细胞免疫印迹的微流控芯片，其特征在于，包括循环肿瘤细胞分选单元、单细胞捕获单元、光活性凝胶电泳分离单元和免疫印迹分析单元，所述循环肿瘤细胞分选单元的末端与所述单细胞捕获单元的前端相通，所述单细胞捕获单元的末端设有光活性凝胶电泳分离单元和免疫印迹分析单元，所述光活性凝胶电泳分离单元和所述免疫印迹分析单元共有凝胶，所述循环肿瘤细胞分选单元被设置为将细胞样本中的循环肿瘤细胞分离分选出来，所述单细胞捕获单元被设置为将分选富集后的细胞实现单细胞的捕获，并在细胞捕获后对细胞进行封闭裂解，所述光活性凝胶电泳分离单元被设置为将细胞裂解后的蛋白推进到芯片上的凝胶涂层区域，通过施加电场使得蛋白根据分子量不同在凝胶中分离，所述免疫印迹分析单元被设置为通过特异性的抗体孵育和洗脱，对靶蛋白分子进行荧光或发光基团标记并检测其信号。

2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述循环肿瘤细胞分选单元包含微流控通道，所述微流控通道采用蛇形设计，所述微流控通道的输入管道的直径为0.15～0.3mm，外侧输出管道的直径为5～10mm。

3.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述循环肿瘤细胞分选单元的末端设有过滤膜，所述过滤膜的孔径尺寸根据待分离的循环肿瘤细胞的尺寸进行调整。

4.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，还包括细胞阱，所述细胞阱设置在所述单细胞捕获单元和所述光活性凝胶电泳分离单元之间，所述细胞阱的直径尺寸根据待分离的循环肿瘤细胞的尺寸进行调整。

5.一种利用微流控芯片进行循环肿瘤细胞的分离及单细胞免疫印迹的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将血液样本进行红细胞裂解的预处理，离心后用大体积PBS或生理盐水稀释重悬，

(2)将经过预处理的细胞样本经由如权利要求1所述的微流控芯片上的微流控通道在循环肿瘤细胞分选单元中进行分选，

(3)纯化与浓缩循环肿瘤细胞，

(4)循环肿瘤细胞的单细胞捕获和裂解，细胞在分选后会被单细胞捕获单元引入细胞阱中，最终达成单个细胞均匀入阱和裂解，

(5)凝胶电泳，细胞在裂解后，在芯片两端施加电场，蛋白在电场的作用下进入芯片表面的凝胶涂层中开始电泳分离，

(6)蛋白质的光敏固定，凝胶电泳结束后，通过对凝胶表面进行激发光照射，使凝胶涂层蛋白条带中蛋白分子和凝胶单体分子原位聚合，而后进行免疫印迹蛋白分析，将固定好的蛋白分子用特异性的一抗及带有荧光或发光基团标记的二抗识别结合，

(7)在激光共聚焦荧光显微镜下，测定目标蛋白分子的荧光信号强度。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)的纯化与浓缩是采用过滤膜，所述过滤膜的孔径尺寸可以根据待分离的循环肿瘤细胞的尺寸进行调整。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(5)的电场为40V/cm，步骤(6)中的激发光的波长为320-360nm，凝胶电泳结束后，所述凝胶经所述激发光照射60s。