[发明专利]optrA耐药蛋白双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供一种用于检测细菌中optrA耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及其检测方法，包括包被有单克隆抗体5C6的酶标板、检测抗体2F3‑HRP、optrA蛋白。本发明选用5C6作为捕获抗体，2F3‑HRP作为检测抗体研制了optrA双抗夹心ELISA检测试剂盒，并对其进行了方法学系统评估，结果显示试剂盒特异性好，灵敏度高，为optrA阳性耐药菌的快速检测提供了一种技术手段。

技术领域

本发明涉及一种用于检测optrA耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及方法，属于免疫学分析技术领域。

背景技术

optrA基因由我国学者于2015年从1株临床分离的粪肠球菌09E349中首次发现，并且已被证明还可以介导细菌对氟化和非氟化氯霉素的耐药性。研究表明，optrA属于ABC蛋白家族，是一种新发现的耐药蛋白，既可介导肠球菌对恶唑烷酮类和利胆醇类抗生素的耐药性，还可以介导金黄色葡萄球菌对氯霉素类的耐药性。optrA被确定存在于中国的人源和动物源的肠球菌中，在中国，人源的主要分布于江西、天津、浙江；动物源的主要分布在河南、山东、上海、广东、西藏。自optrA首次在中国报道后，世界范围内多个国家开始检出optrA阳性的肠球菌，并且在部分国家临床和动物来源菌株（如波兰、哥伦比亚）检出的携带optrA基因的质粒与pE349有很高的相似性，这提示可能存在人畜之间的传播。2016年，意大利也发现了携带optrA基因的肠球菌。由于肠球菌的感染已经成为疾病治疗中的主要问题之一，因此耐药基因optrA的出现和蔓延将有望成为临床治疗肠球菌感染的一个重要靶点。

本发明应用的酶联免疫吸附法（ELISA）具有快速、灵敏、特异性好且操作简便等特点，因此建立一种用于检测optrA基因的双抗夹心ELISA检测试剂盒及方法，对其基因检测和方法开发具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高、特异性强、操作简便、检测快速的检测optrA耐药蛋白的双抗夹心酶联免疫试剂盒及检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于检测细菌中optrA耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：包被有单克隆抗体5C6的酶标板、检测抗体2F3-HRP、optrA蛋白标准品。

在一个实施方案中，所述检测optrA耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：

PCR扩增目的片段并克隆至表达载体pET28a，将成功构建的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG诱导表达，经亲和层析和分子筛层析高度纯化后得到optrA重组蛋白；

上述重组optrA蛋白氨基酸序列为序列1；

在一个实施方案中，所述optrA单克隆抗体5C6，2F3为采用重组optrA蛋白免疫小鼠，经融合、克隆、筛选，得到的；

所述单克隆抗体5C6的重链可变区的氨基酸序列为序列2；

所述单克隆抗体5C6的轻链可变区的氨基酸序列为序列3；

所述单克隆抗体2F3的重链可变区的氨基酸序列为序列4；

所述单克隆抗体2F3的轻链可变区的氨基酸序列为序列5。

在一个实施方案中，所述检测抗体2F3-HRP的制备方法包括如下步骤：

（1）称取5 mg HRP溶于1 mL三蒸水中，逐滴缓慢加入0.20 mL新配的0.1 M NaIO₄溶液，4℃避光搅拌25 min，活化HRP，颜色由棕色变为绿色；上述溶液装入透析袋中，用1 M，pH4.4的醋酸钠缓冲液中4℃过夜透析，然后10000 r/min，4℃，离心10 min，去除沉淀；得到透析后的HRP；