[发明专利]一种从动物低核酸含量样品中提取病毒核酸的方法

说明书

本发明公开了一种能提高动物鼻咽拭子和咬绳唾液等杂质多基质复杂的样本的前处理方法，包括获取动物低核酸含量样品；低核酸含量样品的保护处理；样品混合液的离心处理，取下部包含纳米磁珠的沉淀部分作为待提取液待用；通过自动核酸提取仪对所述待提取液进行核酸提取等步骤。既能解决柱膜法操作繁琐，核酸回收率不高，也能解决传统自动磁珠法上样量小，不能提取颗粒物附着病毒核酸的问题，充分利用表面修饰磁珠的分散和收集方便的特点，进一步优化了传统自动磁珠法的操作方式，大大提高了动物鼻咽拭子和咬绳唾液等杂质多、基质复杂的样本的处理速度和核酸回收率。配合专用的PCR试剂，能较大幅度提高检测灵敏度，有效减少假阴性的产生。

技术领域

本发明涉及动物疫病检测技术领域，特别是一种用于早期动物疫病检测(荧光定量PCR法)前提升核酸提取效率方法，主要应用于从动物鼻咽拭子、咬绳唾液、环境等低核酸含量样品的核酸提取。

背景技术

在动物的疫病检测中，病毒核酸作为判断动物是否患病重要基础依据，因此，在样品中提取病毒核酸的效率直接影响疫病检测判断的准确性。现有提取核酸的方法主要有柱膜法和自动磁珠法。

其中柱膜法是将对核酸有吸附作用的官能团固定在离心柱膜上，通过加入不同的裂解试剂、洗涤试剂并反复离心，已达到核酸与杂质分离的目的，得到纯化的核酸。优点是得到的核酸纯度高，样品处理量大，缺点是操作繁琐，核酸回收率低，难于直接处理杂质多的样品，对吸附在颗粒物中的核酸更是无能为力(因为颗粒物会堵住柱膜，使实验难以进行，要提取杂质上附着的核酸，必须用稀释液把核酸从沉淀物中洗脱下来，再离心去沉淀才能过柱，非常麻烦，回收率还低)。

自动磁珠法是在磁珠表面修饰有对核酸有吸附作用的特定活性官能基团，通过不同的裂解液结合液洗涤液在特定的条件下能够与目的物质进行特异性结合，同时利用磁珠自身的磁性，在外磁场的作用下可以方便的实现定向移动与富集，从而达到核酸与杂质分离的目的，进而实现对目标物质的分离纯化，获得纯化核酸。优点是操作简单，可利用机械化实现高通量操作，配合核酸自动提取仪，在同一时间内可同时实现对数十样品的处理，效率直接提髙数十倍，极大的缩短了提取时间，满足了当前生物学高通量操作的要求，使得在大规模疫情爆发时能够进行快速筛查。此外，磁珠与核酸的特异性结合使得提取率大大增加，使得提取的核酸纯度高、浓度大，适合大规模养殖场发病时对无症状病例的快速筛查。缺点是取样量一般只有200到300μL，对感染早期病毒浓度低的样品就很容易出现漏检的情况。还有一个比较致命的问题是：部分动物的鼻咽拭子、咬绳中唾液样本中的病毒带有电荷，某些病毒会与样品中牙垢和饲料残渣紧密结合，而柱膜法或传统离心法因为不能处理杂质颗粒的原因，需要离心把颗粒物去掉，很大概率会把附着在颗粒物杂质上的病毒核酸也一并去掉，当遇到核酸含量低的样本时就很容易会导致提取不到足够的目标核酸，从而导致假阴性的产生。

发明内容

本发明上述问题，提供一种从动物低核酸含量样品中提取病毒核酸的方法。本发明的技术方案为：

一种从动物低核酸含量样品中提取病毒核酸的方法，包括以下步骤：

(1)获取动物低核酸含量样品；

(2)低核酸含量样品的保护处理，对低核酸含量样品添加样品电荷平衡液，得到样品混合液；

(3)样品混合液的离心处理，对样品混合液中加入纳米磁珠，进行离心处理，得到磁珠混合液；

(4)去除所述磁珠混合液上部的上清液，取所述磁珠混合液下部包含纳米磁珠的沉淀部分作为待提取液待用；

(5)通过自动核酸提取仪对所述待提取液进行核酸提取，得到病毒核酸。

作为本发明进一步地说明，所述低核酸含量样品为鼻咽拭子样品、咬绳唾液样品和环境样品。

更进一步地，所述步骤(2)中的电荷平衡液为包含抗生素的PBS溶液。