[发明专利]一种用于快速高效扩增人B淋巴细胞体外扩增的细胞及其构建方法

说明书

本发明公开了一种用于快速高效扩增人B淋巴细胞体外扩增的细胞及其构建方法。本发明构建了一种用于快速高效扩增人B淋巴细胞体外扩增的细胞，所述细胞为过表达CD40L基因、IL21基因和BAFF基因的细胞。进一步利用其进行B淋巴细胞的体外扩增。本方法比传统方法提高B细胞产量5～10倍，时间缩短三分之二，而且可明显降低实验费用。本发明能在短时间内快速大量的体外扩增B细胞，用于T细胞刺激的抗原提呈，刺激肿瘤相关抗原与特异性抗原T细胞的扩增与分离。本技术的建立与推广，将有利于推动中国癌症病人的特异性免疫治疗(TCR‑T)的开发与应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种用于快速高效扩增人B淋巴细胞体外扩增的细胞及其构建方法。

背景技术

肿瘤免疫治疗是指利用生物制剂(如多肽、免疫佐剂、细胞因子、单克隆抗体等)直接或者间接的激发和增强抗肿瘤免疫应答和打破肿瘤免疫抑制效应，抑制肿瘤的生长或者直接杀伤肿瘤细胞。它是除了手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术，近几年进展快速，已逐步进入临床应用。

TCR-T免疫治疗是特异性肿瘤治疗中的过继性细胞免疫疗法。选择患者所带有的一种或者多种肿瘤抗原作为过继细胞治疗的靶标，获得肿瘤抗原表位及特异性TCR序列，利用基因工程技术，将编码抗原特异的TCR基因序列转染至患者自身的T细胞，使普通淋巴细胞转变为特异性识别肿瘤抗原的T淋巴细胞，大量扩增后回输至病人体内以达到杀伤肿瘤细胞的目的。肿瘤过继T细胞治疗的靶标为各种肿瘤抗原，克隆肿瘤抗原特异性TCR是TCR-T细胞治疗研发的重点。制备各种抗原提呈细胞是研发的基础。

抗原提呈细胞在免疫应答中位于初始环节，在克隆肿瘤抗原特异性TCR的过程中至关重要。抗原提呈细胞是一群在免疫应答中，摄取、加工、提呈抗原并激活下游T细胞的免疫细胞亚群。主要包括巨噬细胞、B细胞和树突状细胞(Dendritic cell，DC)。

DC是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，但DC在PBMC中所占百分比不到1％，而且他们很难体外培养扩增并且寿命有限。因此DC细胞的数量很难满足科学研究与临床应用的大量需求。

B淋巴细胞通过表面所表达的高亲和力B细胞抗原受体(BCR)能够有效地摄取、内吞和加工抗原。B细胞同时表达MHC-I、II分子，以及T细胞激活所需的共刺激分子，形成免疫突触，将抗原提呈给MHC分子，识别抗原后，可有效刺激T细胞活化。

B细胞在体外拥有扩增的潜能，虽然在普通的培养液中不能生存与扩增，但是特殊的条件下能够扩增。因此，B细胞可以作为优良的抗原提呈细胞，在体外大量扩增，用于肿瘤抗原特异性免疫治疗的研发。

B细胞表面表达CD40分子，在CD40配体(CD40L)作用下给B细胞提供生存的信号；BAFF分子为B细胞活化因子，能够增强B细胞的存活；IL21为B细胞的生长因子。这些分子的不同组合用于在体外培养扩增B细胞。

但是现有的体外培养扩增B细胞的方法，B细胞在体外不能单独存活，需要额外添加很多生长因子或激素，并且B细胞产量较低，例如CN200710020522.8可溶性CD40L刺激人外周血B细胞长期培养方法，需要添加胰岛素。在研究抗肿瘤T细胞体外刺激过程中，抗原提呈细胞是一个限速因素，限制了TCR-T免疫治疗的发展和应用。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种用于快速高效扩增人B淋巴细胞体外扩增的细胞及其构建方法。

本发明的第一个目的是提供一种用于快速高效扩增人B淋巴细胞体外扩增的细胞。

本发明的第二个目的是提供一种所述细胞在快速高效体外扩增人B淋巴细胞中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种快速高效体外扩增人B淋巴细胞的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：