[发明专利]一种华北落叶松胚性组织超低温保存的方法

说明书

本发明公开了一种华北落叶松胚性组织超低温保存的方法，包括对华北落叶松胚性组织(华北落叶松的细胞系胚性愈伤组织)进行渗透剂浓度逐渐升高的液体梯度预培养处理。梯度预培养处理后的华北落叶松胚性组织进行超低温冷冻保存，使用时再进行解冻处理。本发明方法适于对华北落叶松的优良胚性细胞系的长期超低温保存，采用本发明方法长期保存华北落叶松胚性细胞后，细胞存活率高，胚性组织恢复培养迅速，而且胚性愈伤组织恢复生长率高，达到66％以上。

技术领域

本发明涉及一种植物愈伤组织的保持方法，特别涉及一种华北落叶松细胞系胚性愈伤组织的低温保存方法，属于林木育种的组培技术领域。

背景技术

常温条件下，胚性培养物的长期继代保存，往往存在着许多不可避免的问题：首先，长期重复的继代保存，继代成本高；并且，如果在操作过程中出现人为或环境干扰，造成培养物的污染，很可能造成胚性细胞系的重大损失；更加值得注意的是，经过长时间的继代培养，可能会引起体细胞无性系变异，从而导致胚性培养物胚性能力的下降甚至丧失。超低温冷冻保存技术是目前应用十分广泛和成功的种质长期保存的方法，它能够有效地遏制变异的发生，保存胚性材料的发育潜能，且以最少的量和最低的风险保存材料的完整性。国外采用体细胞胚胎发生快速繁殖已成为针叶树优质苗木规模化生产的重要途径，而且体细胞胚胎发生技术可以和冷藏保存法结合起来。将植物组织长期储存于液氮中，便于进行长期无性系试验。

现有植物胚性愈伤组织保存方法主要有如下两种，培养继代保存法和超低温冷冻保存法，其中超低温保存方法需要在低温保存前对组织进行预培养，使愈伤组织适当脱水，降低细胞内含水量，使细胞的分裂与分化同步，从而增强材料在面对低温保存过程中剧烈的温度变化和高度脱水时的抗逆境能力。针叶树胚性组织的超低温保存预培养的常见方法是预培养时培养基中添加高浓度蔗糖、山梨醇等，提高渗透压，使细胞脱水，以达到增加抗寒能力的作用。

虽然现有的低温冷冻保存方法能够在一定程度上降低遗传变异频率，保证遗传稳定性以及细胞活力和形态发生的潜能保存，但是不同超低温冷冻保存方法中预培养时间、预培养基成分及预处理等不同，胚性组织恢复，解冻后的细胞存活率以及恢复生长率也不同。例如：申请号为CN201910437126.8的发明专利申请公开了一种抗松材线虫病马尾松胚性愈伤组织超低温保存方法，将马尾松细胞系的胚性愈伤组织置于含有蔗糖的增殖培养基中预处理后，于冷冻管中，加入冷冻保护剂，进行程序降温，温度降至-80℃后取出冷冻管并迅速投入液氮，进行超低温保存；使用时，取超低温保存胚性愈伤组织水浴温度为30℃～40℃条件下进行解冻，待冰完全溶化后立即将冷冻管取出，虽然在30-35℃解冻后的胚性愈伤组织细胞活性最高达100％，超低温保存后的愈伤与正常增殖的愈伤组织在外观及显微结构上无明显差异，且低温保存后的愈伤组织仍具有分化形成体胚的能力，但上述专利在冷冻保存前，才将固体培养物放在液体中分散，再进行预培养。本专利采用的是长期继代保存的液体增殖培养物，本身组织分散性、均一性更好，且组织长期在液体培养基中生长，适应性更强。

本发明就华北落叶松胚性细胞系超低温冷冻保存进行探究，探讨适合于华北落叶松胚性培养物超低温冷冻保存中材料预培养、冷冻保存方式等流程的方法，以期为长期稳定低保存华北落叶松胚性培养物等种质资源奠定技术基础。

发明内容

本发明的目的是针对现有植物愈伤组织超低温保存过程中存在预处理方法、冷冻保护剂及超低温保存后的解冻方法等方面的缺陷，提供一种华北落叶松胚性组织超低温保存的方法，通过调整预处理培养基培养以提高预培养效率和恢复生长效率。本发明方法通过液体梯度预处理与采用混合型冷冻保护剂更适合于华北落叶松胚性愈伤组织的冷冻保存，且在37℃水浴解冻后的胚性愈伤组织细胞活性最高达78％，超低温保存后的愈伤与正常增殖的愈伤组织在外观及显微结构上无明显差异，且低温保存后的愈伤组织仍具有分化形成体胚的能力。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种华北落叶松胚性组织超低温保存的方法，包括对华北落叶松胚性愈伤组织进行渗透剂浓度逐渐升高的液体梯度预培养处理。