[发明专利]一种华北落叶松胚性组织超低温保存的方法

权利要求书

1.一种华北落叶松胚性组织超低温保存的方法，其特征是，包括如下顺序进行的步骤：

1）将华北落叶松胚性愈伤组织置于含有渗透剂的液体增殖培养基中进行液体梯度预培养处理，其中：

所述液体梯度预培养处理为在液体培养过程中，向液体培养基中逐步添加渗透剂，且渗透剂的添加量梯度升高，包括如下步骤：

1-1）将华北落叶松的细胞系胚性愈伤组织置于第一预培养基中，进行第一阶段液体预培养处理20-36h，其中，所述第一预培养基为含有渗透剂浓度为0.1-0.3 mol/L的液体增殖培养基；

1-2）第一阶段液体预培养结束后，将愈伤组织取出再置于第二预培养基中，进行第二阶段液体预培养处理20-36h，其中所述第二预培养基为含有渗透剂浓度为0.3-0.5 mol/L的液体增殖培养基；

所述液体增殖培养基为： 1/2 LV+2,4-D 0.1-0.3mg/L+6-BA 0.05-0.15mg/L+蔗糖30g/L +水解酪蛋白400mg/L+谷氨酰胺500mg/L；所述渗透剂选择山梨醇或蔗糖；

2）在液体梯度预培养处理后，采用60目和100目细胞筛过滤，滤除培养液，将获得的液体梯度预培养处理后的胚性愈伤组织置于冷冻管内，加入复合冷冻保护剂，进行程序降温，温度降低至-40℃后取出，然后投入液氮中进行超低温保存，其中所述复合冷冻保护剂为：DMSO和山梨醇或DMSO和蔗糖，其中所述复合冷冻保护剂中DMSO的浓度≤10%；所述山梨醇的浓度为0.3-0.5 mol/L；所述蔗糖的浓度为0.3-0.5 mol/L；

3）使用时，取出超低温保存胚性愈伤组织的冷冻管，进行解冻处理。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述渗透剂为山梨醇。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征是，步骤1）中所述液体增殖培养基为：1/2 LV+2,4-D 0.2mg/L+6-BA 0.1mg/L+蔗糖30g/L +水解酪蛋白400mg/L+谷氨酰胺500mg/L。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征是，步骤1）中所述渗透剂在液体增殖培养基中的浓度为0.1-0.5mol/L。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征是，步骤1）中所述渗透剂在液体增殖培养基中的浓度为0.2-0.4 mol/L。