[发明专利]一种胃蛋白酶ssDNA适配子的筛选鉴定方法

说明书

一种胃蛋白酶ssDNA适配子的筛选鉴定方法，属于生物医疗技术领域，方法科学合理，在分离方法上，利用磁珠作为介质，利用磁力架进行分离，显著地提高了分离效率，磁珠‑SELEX筛选过程中，确保整个过程在液相中进行，不会破会靶标物质的结构；与磁珠结合的靶标物质可以在整个反应中与文库进行充分的接触；磁力架使整个磁珠‑SELEX筛选更加简单，操作方便；由于磁珠与文库的结合能力可以忽略不计，减少了传统离心和亲和层析、毛细管电泳等的不足；本发明中采用不对称PCR的方法进行ssDNA分离，当低浓度引物被使用完后，高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量的ssDNA，整个筛选过程中对每一个步骤都进行优化，确保整个筛选使寡聚核酸能得到很好的富集。

技术领域

本发明属于生物医疗技术领域，涉及一种蛋白酶的筛选鉴定方法，具体的 说是涉及一种胃蛋白酶ssDNA适配子的筛选鉴定方法。

背景技术

胃出血是危重消化道疾病，肝硬化导致的门脉高压伴食管与胃底静脉曲张、 水杨酸制剂(阿司匹林)等导致的损伤、脑出血等引起的应激性溃疡、胃溃疡、 急性糜烂性胃炎、过敏性紫癜及息肉均会引起程度不等的胃出血，不同于其它 出血症，胃出血点所处环境特殊，强酸性的胃液和高活性的胃蛋白酶使凝血酶 无法发挥作用。因此，一旦发病，若不及时止血，酸和酶解将使创伤面很快扩 大，在短时间内，患者即会因出血过多而休克，进而导致生命危险。传统的胃 出血诊断一般是进行胃镜检查，该技术对从医者的技术要求很高，花费多且造 成患者痛苦。由于胃出血会使胃壁异常，大分子物质渗透性增加，使原本不应 该出现在血液中的胃蛋白酶通过受损伤的粘膜进入血液循环，使血胃蛋白酶浓 度异常，因而胃蛋白酶可作为胃出血疾病的标志物，鉴定胃蛋白酶可以帮助医 生快速诊断出早期胃出血疾病，进而挽救更多生命。

核酸适配体，是利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)从特定的寡核苷 酸库中筛选出的对靶标有特异亲和性的单链DNA(ssDNA)或RNA，核酸适配子和 靶标分子会通过静电作用以及氢键作用等，折叠形成复杂的三级结构，如发卡 结构、假结结构、凸环结构和G-四分体结构。图1表述了单链DNA片段与靶标 物质的结合过程。图2则表述了在适配子的链内与碱基互补配对结合，形成稳 定的二级结构，然后通过氢键作用，将自身折叠，形成复杂的三级结构。

核酸适配子的靶标物质种类非常多样，小到细胞因子和分子，大到细胞甚至 个体等，其中蛋白质类靶标分子最多，核酸适配子与靶标物质的结合方式就是 配基-配体的结合形式，会形成一种稳定的结合力很强的复合物。因此，核酸适 配子与靶物质有着极高的亲和力，通常它们之间的解离常数甚至能够达到皮摩 尔水平。

核酸适配子的应用很广泛，但是在医学上的应用能够将其的价值发挥到最 大，给一些无法攻克的疾病带来了希望，尤其是癌症等疾病。在这众多的适配 子中最具代表性是2005年FDA提出的第一个核酸适配体药物“Macugen”，该适 配子作为药物可以用于治疗老年黄斑变性，它的上市成为核酸适配子领域的一 个里程碑；目前还有Tang课题组筛选出能够与肝癌、肺癌细胞特异结合的多 簇单链DNA适配体；Chen等筛选出针对丙型肝炎(HCV)活病毒的适配体，成为 HCV患者的最佳诊断试；Li筛选出以导管癌患者的癌组织切片为靶标的RNA适 配体等等。

从目前来看，核酸适体一定能够成为一种非常行之有效的工具，能够在生物 医学检测及诊疗方面发挥重要的作用。但以胃蛋白酶为靶标的适配子筛选体系 还没有建立，因此，有必要设计出一种可用于检测血液中的胃蛋白酶，又可使 适配子与胃蛋白酶结对凝血酶的水解，治疗胃出血的胃蛋白酶适配子的筛选鉴 定方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，提出一种胃蛋白酶ssDNA适配 子的筛选鉴定方法，利用SELEX技术，以与磁珠偶联的胃蛋白酶作为靶分子， 从体外80nt的随机寡核苷酸文库中筛选出与胃蛋白酶特异性结合的适配子，并 对适配子对胃蛋白酶活性的抑制率进行测定，用生物素标记适配子，筛选出抑 制胃蛋白酶功能位点适配子，为胃出血的临床诊断以及治疗提供了新的思路。