[发明专利]一种胃蛋白酶ssDNA适配子的筛选鉴定方法

权利要求书

1.一种胃蛋白酶ssDNA适配子的筛选鉴定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)随机寡聚核苷酸文库与胃蛋白酶孵育

(1-1)将体外合成的长度为80nt的ssDNA文库于4000rpm离心30-60s；

(1-2)用1×选择缓冲液溶解，充分震荡95℃变性5min，变性完成后立即至于4℃冰箱10min；

(1-3)文库与BSA封闭的EP管37℃反应1h；

(1-4)加入100μL偶联胃蛋白酶磁珠，150μL结合缓冲液洗涤3次；

(1-5)将偶联了磁珠的胃蛋白酶与ssDNA孵育，37℃1h；

(1-6)反应后，将离心管放置至磁力架上3-4min，去除上清；

(1-7)用1×洗涤缓冲液进行冲洗，如此重复2次；

(1-8)至磁力架3-4min，吸弃上清液，加入200μL的去离子水，100℃加热5min，至磁力架3-4min，去上清为模板，进行PCR扩增；

(1-9)在筛选的过程中可以加入反筛过程，将胃蛋白酶换成50mM的醋酸钠，对磁珠进行活化，进行包裹，作为对照组，反筛的目的是减少非特异性筛选，孵育1h，并将孵育过的磁珠利用磁力架进行分离，将磁珠收集，将溶液收集到新的离心管中,之后的步骤从1-5开始与正筛相同；

(2)对称PCR扩增

(2-1)通过梯度PCR预实验，得到最佳退火温度为58℃，最佳循环轮数为30个循环；

(2-2)从PCR反应液体中回收；

(3)ssDNA的分离；

(3-1)通过不对称PCR，得到上下游比例为100：1；

(3-2)从3％的琼脂糖凝胶中回收dsDNA；

(4)进行新的一轮筛选；

(5)重复操作步骤(1)至步骤(4)，直至循环结束。

2.根据权利要求1所述的一种胃蛋白酶ssDNA适配子的筛选鉴定方法，其特征在于，步骤(1-4)中所述的偶联胃蛋白酶磁珠，具体磁珠偶联操作方法如下：

(1)磁珠活化

①将1.5mL离心管中放置在磁性分离器上，磁珠震荡混匀后取10μL到离心管中，1-2min后等到固液分离后去除上清；

②取200ul MES将磁珠洗涤2次，取上清；

③在装有磁珠的离心管中加入现配置的50μL EDC溶液和50μL NHS溶液，在旋涡仪上混匀1min，使磁珠与溶液充分接触，37℃恒温箱混合培养30min；

④反应结束后，加入100μL MES溶液洗涤两次；

(2)蛋白偶联

①将离心管置入磁力架，分离上清液，加入100μL的胃蛋白酶溶液，轻柔的混匀；

②在室温下混匀2h，或在4℃下垂直混合过夜；

③反应结束后，磁性分离去除上清，加入100μL MES溶液洗涤两次；

④反应结束后将离心至于磁性分离器上，静止2min，吸弃上清液，在室温下，加入Tris缓冲液，旋涡混匀15min，该步骤用来封闭多余的活性位点；

⑤反应结束后，用50mM Tris缓冲液洗涤4次；加入20μLTriton-100于离心管中，用来减少非特异性吸附；

⑥加入50μLTris保存液。