[发明专利]一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法

权利要求书

1.一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、对待测活性污泥进行离心分离，收集固体样品；采用缓冲液对固相产物进行反复冲洗；采用缓冲溶液对冲洗后的固相样品定容，至待测活性污泥的原始容积，并混合均匀，得到活性污泥样品；

步骤2、对活性污泥样品进行破碎，离心，得到上清液；在上清液中加入苯乙醇和十二烷基-beta-D-麦芽糖苷进行反应，反应结束后，离心，得到待测一氧化氮还原酶样品；

步骤3、在厌氧状态下，向密闭容器中加入缓冲溶液、抗坏血酸钠溶液、乙酸钠溶液及吩嗪硫酸甲酯溶液，并充入一氧化氮气体，得到酶活性反应液；在酶活性反应液中加入步骤2中的待测一氧化氮还原酶样品，震荡后，利用气相色谱法，测定氧化亚氮的含量，进而计算得到一氧化氮还原酶的活性；

步骤1中，冲洗过程中的缓冲液采用20-200mM的Tris-HCL缓冲液，pH为7.5-8.0；

步骤1及步骤3中，缓冲溶液采用在5-50mM的Tris-HCL缓冲液中加入KCl配制得到，其中，KCl的浓度为15-150mM；

步骤2中，将活性污泥样品置于低温高压细胞破碎仪中进行破碎；

步骤2中，苯乙醇及十二烷基-beta-D-麦芽糖苷的体积比为(0.1-0.5)：(0.1-0.5)；其中，苯乙醇溶液的质量浓度为0.02％、十二烷基-beta-D-麦芽糖苷的质量浓度为1％；

酶活性反应液中缓冲溶液、抗坏血酸钠溶液、乙酸钠溶液及吩嗪硫酸甲酯的体积比为2.6:0.1:0.1:0.1；其中，抗坏血酸钠溶液的浓度为1-1.5M，乙酸钠溶液的浓度为2.5-3M，吩嗪硫酸甲酯溶液的浓度为0.25-0.5mM；

步骤2中，破碎后的离心过程，采用在5000-6000g条件下，离心时间为10-15min；反应后的离心过程，采用在40000-186400g条件下，离心时间为90-120min；

步骤2中，破碎压力为500-1000bar。

2.根据权利要求1所述的一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法，其特征在于，步骤1中，离心过程，离心转速为4000-5000r/min，离心时间为5-15min。

3.根据权利要求1所述的一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法，其特征在于，步骤1及步骤2的温度条件为4℃以下。

4.根据权利要求1所述的一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法，其特征在于，步骤3中，采用在恒温培养摇床上进行震荡，温度为28-30℃，震荡转速为150-180r/min，震荡时间为20-30min。