[发明专利]一种多抗筛选的杨树多基因遗传转化方法有效

申请号：	202010463941.4	申请日：	2020-05-27
公开（公告）号：	CN113755519B	公开（公告）日：	2023-06-27
发明（设计）人：	付春祥;杨松;吴振映;曹英萍;刘文文;卢孟柱;周功克	申请（专利权）人：	中国科学院青岛生物能源与过程研究所;青岛天韵生态科技有限公司
主分类号：	C12N15/82	分类号：	C12N15/82;C12N15/65;C12Q1/6895;C12Q1/686;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/00
代理公司：	北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 11465	代理人：	崔自京
地址：	266000 山***	国省代码：	山东;37
权利要求书：	查看更多	说明书：	查看更多
摘要：
搜索关键词：	一种多抗筛选杨树多基因遗传转化方法
钻瓜网技术展会专利词库专利权人专利榜在售专利公布日期热门专利

【权利要求书】：

1.一种多抗筛选的杨树多基因遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）侵染步骤：用含有携带不同抗性载体组合的农杆菌侵染液侵染带划痕的杨树叶片或切成条的杨树叶片10~15min，得到侵染叶片；

其中所述携带不同抗性载体组合为pBI121、pCambia1305和pEarlygate103的任意组合；所述携带不同抗性载体组合对应的抗生素组合为hygromycin B + G418 sulfate、G418sulfate + bialaphos、hygromycin B + bialaphos和hygromycin B + G418 sulfate +bialaphos；

（2）遗传转化步骤：

（21）侵染叶片倒置于共培养培养基上，黑暗环境下共培养1~3天，得到共培养叶片；

所述共培养培养基为：以改良的WPM为基础培养基，再添加0.1g/L肌醇+20g/L蔗糖+0.5g/L MES+0.65g/L葡萄糖酸钙+(0.5‰～0.7‰)的2mg/mL 2 ,4-二氯苯氧乙酸+(0.04‰～0.07‰)的2mg/mL 6-糠基氨基嘌呤+7.8g/L Agar或4.5g/L phytagel+1‰的100mM乙酰

丁香酮，pH＝5.9～6.0；

（22）将带划痕的共培养叶片沿伤口撕开后放置在含有载体抗性对应的抗生素组合的筛选培养基上进行筛选培养，当愈伤组织生长至0.5~1.0cm，得到待分化愈伤组织；

或将切成条的共培养叶片放置在含有载体抗性对应的抗生素组合的筛选培养基上进行筛选培养，当愈伤组织生长至0.5~1.0cm，得到待分化愈伤组织；

所述筛选培养根据所含对应抗性抗生素的浓度不同分为低浓度筛选培养阶段和高浓度筛选培养阶段，所述共培养叶片在低浓度筛选培养基上长出愈伤组织后，继代到高浓度筛选培养基上，其中培养条件为黑暗环境，温度23~25℃，继代频率为两周一次；

其中，低浓度筛选培养基为：在共培养培养基的基础上，去掉乙酰丁香酮，再添加1‰的300mg/mL特美汀+(0.01‰～0.02‰)的50mg/mL G418 sulfate和/或(0.04‰～0.06‰)的10mg/mL bialaphos和/或(0.03‰～0.04‰)的50mg/mL hygromycin B，pH＝5.9～6.0；

高浓度筛选培养基为：在低浓度筛选培养基的基础上，调整抗生素的含量为(0.02‰～0.04‰)的50mg/mL G418 sulfate和/或(0.14‰～0.15‰)的10mg/mL bialaphos和/或(0.03‰～0.04‰)的50mg/mL hygromycin B，pH＝5.9～6.0；

（23）待分化愈伤组织在含有载体抗性对应的抗生素组合的分化培养基上进行分化培养，当不定芽生长至1.0~2.0cm，得到待生根不定芽；

所述分化培养基为：以改良的WPM为基础培养基，再添加0.1g/L肌醇+20g/L蔗糖+0.5g/L MES+0.65g/L葡萄糖酸钙+(0.5‰～0.7‰)的1mg/mL 6-苄基氨基嘌呤+(0.02‰～0.04‰)的2mg/mL萘乙酸+ (0.02‰～0.05‰)的1mg/mL TDZ+7.8g/L Agar或4.5g/Lphytagel+1‰的300mg/mL特美汀+(0.02‰～0.03‰)的50mg/mL G418 sulfate和/或(0.08‰～0.1‰)的10mg/mL bialaphos和/或(0.02‰～0.03‰)的50mg/mL hygromycinB，pH＝5.9～6.0；

（24）待生根不定芽在含有载体抗性对应的抗生素组合的生根培养基上进行生根培养，得到生根幼苗；

所述生根培养基为：2.215g/L MS粉+10g/L蔗糖+1‰的300mg/mL特美汀+(0.01‰～0.02‰)的50mg/mL G418 sulfate和/或(0.08‰～0.1‰)的10mg/mL bialaphos和/或(0.02‰～0.03‰)的50mg/mLhygromycin B，pH＝5.9～6.0；

鉴定：对生根幼苗DNA所携带的载体抗性基因进行鉴定，鉴定引物包括：

kan-F: GGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGA，SEQ ID NO.1；

kan-R: GCTATGACTGGGCACAACAGACAAT，SEQ ID NO.2；

hph-F: AAGGAATCGGTCAATACACTACATGG，SEQ ID NO.3；

hph-R: AAGACCAATGCGGAGCATATACG，SEQ ID NO.4；

bar-F: CCGTACCGAGCCGCAGGAAC，SEQ ID NO.5；

bar-R: CAAATCTCGGTGACGGGCAGGAC，SEQ ID NO.6；

其中，步骤（2）所述改良的WPM配方如下表所示

。

下载完整专利技术内容需要扣除积分，VIP会员可以免费下载。

免登录下载普通用户下载升级VIP会员，免费下载

该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于中国科学院青岛生物能源与过程研究所;青岛天韵生态科技有限公司，未经中国科学院青岛生物能源与过程研究所;青岛天韵生态科技有限公司许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】