[发明专利]一种表达SARS-CoV-2 S基因的重组植物乳酸菌及其制备方法

说明书

本发明涉及生物医药工程技术领域，且公开了一种表达SARS‑CoV‑2主要抗原基因S的重组植物乳酸菌的制备方法，通过本发明选用植物乳杆菌表达含1320信号肽和DCpep以及优化的SARS‑CoV‑2 S基因，选择乳球菌NZ3900作为克隆中间宿主，获得高含量的重组质粒；再使用植物乳杆菌Lp18表达SARS‑CoV‑2 S蛋白，建立有效的制备及鉴定方法，优化检测手段，为开发SARS‑CoV‑2口服候选疫苗奠定理论基础，本发明建立了重组表达SARS‑CoV‑2 S蛋白的植物乳杆菌，丰富了植物乳杆菌表达异源蛋白的可行性,也为SARS‑CoV2病毒口服疫苗的研发提供了前提。

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体为一种表达SARS-CoV-2 S基因的重组植物乳酸菌及其制备方法。

背景技术

SARS-CoV-2作为引起新冠肺炎(coronavirus disease 2019， COVID-19)的致病原，截止目前，全球感染人数超过70万，造成冠状病毒感染历史的最大规模流行。该病毒能够高度亲和病毒受体ACE2，导致人群中极高的传染性，而SARS-CoV-2的刺突蛋白S相比于SARS-CoV S对受体具有更高的亲和性，这也导致其成为第七种感染人类的冠状病毒，且感染性最强。大量研究表明冠状病毒S基因不但是病毒受体的唯一结合蛋白，而且其免疫原性强，是最适合作为候选疫苗开发的抗原物质。尽管已经有多家企业和科研机构开展了疫苗的研究工作，但是目前仅有基于腺病毒载体的新冠疫苗获批进入临床研究阶段。因此，新冠疫苗的研发仍处于初始阶段，而且缺乏有效的表达系统用于黏膜递送。

乳酸菌是一类无芽孢、G+和发酵产物为乳酸的细菌统称，具有益生菌特性、无内毒素和细胞外分泌等特点，其在胃肠道中广泛存在，能够耐受胃酸和胆盐等极端环境；具有较强的黏附定植肠道上皮细胞的能力。鉴于其安全性，乳杆菌作为基因工程菌表达异源蛋白已经得到广泛验证，如干酪乳杆菌表达PEDV的N蛋白，植物乳杆菌NC8表达H9N2的NP蛋白。因此，依赖乳酸菌载体表达和递送系统具有安全、高效、诱导机体粘膜免疫的特点。

发明内容

本发明提供了一种表达SARS-CoV-2S基因的重组植物乳酸菌及其制备方法，具备构建的重组乳杆菌具有潜在黏膜免疫应用价值，为开发SARS-CoV-2新型口服疫苗鉴定基础的优点，解决了背景技术中提到的问题。

为实现以上目的，本发明提供如下技术方案予以实现：

一种表达SARS-CoV-2 S基因的重组植物乳酸菌，其特征在于，整合有SARS-CoV-2S基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种表达SARS-CoV-2 S基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1:引物设计及合成；

S2：SARS-CoV-2 S基因扩增，以本实验保存的pGH-SARS-CoV-2 S 质粒为模板，进行PCR；

S3：重组乳杆菌表达质粒的构建及鉴定；

S4：重组乳杆菌的诱导表达，挑取转化后的阳性重组植物乳杆菌 Lp18；

S5：重组乳杆菌表达产物的鉴定；

S6：外源基因表达的间接免疫荧光验证；

S7：外源基因表达的流式细胞分析。

可选的，S1中所述引物的序列如SEQ ID No.2～5所示。

可选的，S2的反应体系为：Ex Taq酶0.5ul，buffer2.5ul，dNTPs 2ul，模板1ul，引物F01、R01各1ul，无菌水补足25ul。反应条件： 94℃15s，55℃30s，72℃1min，共30个循环。