[发明专利]一种降低新霉素杂质C的工程菌及用途

说明书

本发明公开了一种降低新霉素杂质C的工程菌及用途，也公开了工程菌的构建方法，所得工程菌的保藏号为CGMCC No.18778，本发明从菌种源头减少了新霉素杂质C的含量，可使产品质量达到国际最高标准，实现较高的销售价格和经济效益，同时也减少了提取分离的难度和废水排放量，可收到较好的环保社会效益。

技术领域

本发明属于微生物制药领域，具体涉及新霉素杂质C组分降低改造的工程菌的构建及其应用。

背景技术

链霉菌(Streptomyces)是一类高GC含量的革兰氏阳性土壤丝状细菌，属于原核生物界放线菌纲链霉菌科。除了具有复杂的发育分化，它还能够产生丰富的次级代谢产物，比如大环内酯类、聚酮类、氨基糖苷类等各类别的抗生素。这些抗生素对多种菌株具有不同程度的抑菌杀菌能力，还可以作为抗癌药、除草剂、酶抑制剂、免疫调节剂等，在医疗、工业、农牧渔业和环境保护等领域发挥着重要作用。

新霉素是一种氨基糖苷类抗生素，1949年首次从弗氏链霉菌和白浅灰链霉菌中分离出来，它主要与细菌核糖体30S亚基结合从而抑制细菌合成蛋白质，对G⁺、G^-菌、结核杆菌等均有抑制作用，具有广谱抗菌性，参见Waksman SA，Lechevalier HA.(1949).Neomycin，anew antibiotic active against streptomycin-resistant bacteria，includingtuberculosis organisms.Science.109(2830)：305-307。此外，也有研究表明新霉素很有可能成为一种极具开发潜力的抗肿瘤药物，参见Bottero V.，(2013). Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus-positive primary effusion lymphoma tumor formation inNOD/SCID mice isinhibited by neomycin and neamine blocking angiogenin′snuclear translocation.Journal of Virology 87(21)：11806-11820；Hu GF(2001)Neomycin inhibits the angiogenic activity of fibroblast and epidermal growthfactors.Biochemical Biophysical Research Communication 287(4)：870-874。由于新霉素具有一定的耳毒性，因此限制了它在临床上口服和注射等方面的使用，只有少量被制成药膏应用于皮肤消炎。目前它主要作为兽用抗生素使用，可防治畜禽肠道感染、白痢、伤寒及呼吸道疾病，它还能提高饲料利用率，促进禽畜、鱼类生长，故而也常被用作饲料添加剂。1994年，Rooing和 Fagerberg提交于美国FDA的新霉素在动物机体内药代动力学的报告表明了其对于动物的高度安全性，因而成为了国外最为常用的兽用抗生素之一。新霉素属于多组分抗生素，它的活性与所携带的氨基数目及所在位置息息相关，主要有新霉素A、新霉素B及新霉素C三种组分，其中主要有效组分新霉素B相对于其他组分活性强，毒性弱；新霉素A也称新霉胺，是合成途径中的前体物质，在合成的过程中很快被催化转换且含量低，在工业生产上并未将其作为主要副产物来看待；新霉素C是合成新霉素B的前体，仅在氨基糖5”’位置的构型不同(新霉素B为L型)，由于其较弱的生物活性和较强的毒性，且工业生产上产量积累较多，其结构和亲水性与新霉素B相近，故而较难将二者分离，在工业生产上将新霉素C看作是一种杂质。目前的新霉素生产工艺中新霉素C的含量仍然较高，此前所应用的物理诱变、化学诱变等策略筛选突变株不仅费时耗力、具有盲目性，且突变后稳定性差，无法满足当前降低杂质新霉素C 组分含量的需求。因此，获得有效组分产量高、杂质含量低，遗传稳定性好的工业生产菌株是目前急需解决的关键问题。