[发明专利]一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法

说明书

本发明涉及反向遗传操作技术领域，公开了一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法。分别将新城疫病毒的NP、P和L基因以及表达T7 RNA聚合酶的DE3基因克隆进pXJ40载体，获得质粒pXJ40‑NP、pXJ40‑P、pXJ40‑L和pXJ40‑DE3；将新城疫病毒的全基因组cDNA克隆进pBR322质粒中得到pBR322‑DHN3；将NP基因编码区部分密码子统一替换成使用频率最高的密码子，替换到pBR322‑DHN3质粒上，形成新质粒pBR322‑mNPDHN3；采用上述5种质粒共转染BHK‑21细胞，得到拯救病毒rDHN3‑mNP。本发明方法更利于病毒的拯救和病毒致病机制的研究。

技术领域

本发明涉及反向遗传操作技术领域，具体为一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法。

背景技术

新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起的一种主要侵害鸡、火鸡、野禽及观赏鸟类的高度接触传染性、致死性疾病，俗称鸡瘟。属高度接触性、急性、烈性传染病。人类偶会感染，表现为结膜炎。世界卫生组织(OIE)将其列为必须通报的传染病，我国农业部也将其列为必须通报的一类动物疫病。因其传播速度快且发病和病死率均可达100％，一旦波及将严重危害家禽业，造成不可估量的损失。

据流行病学调查，NDV的流行基因型随时间和地理环境而变化。上世纪20-50年代主要流性I-IV型，70年代首次发现V型主要在南美和中美以致全欧洲。80年代出现VI型并盛行于中东、亚洲和欧洲。85年VII型开始蔓延，并与VIII型流行于世界多个国家并在90年代导致在亚洲、非洲和中东的大流行。V-VIII型均为强毒。IX和X型尚局限在局部散发状态。由于针对IV型的疫苗得到了广泛应用，IV型NDV已得到良好控制。但针对其它基因型的疫苗尚欠缺从而均有流行的趋势。因此利用反向遗传克隆技术迅速开发针对实时流行株的高效、广谱、安全甚至多价的弱毒苗势在必行。此外，由于疫苗的广泛使用使疫检更加困难。因为无法甄别被感染鸡携带的是疫苗株还是野生毒株。通过重组方式可引入人工标签，使其能与野毒有效鉴别。

鸡新城疫病毒(NDV)属于单股负链RNA目，副粘病毒科副粘病毒属。该病毒具有一个双脂层囊膜，内衬一层M蛋白。膜外被具有纤突的糖蛋白(HN和F)包被使之外形呈花穗状。囊内含有由壳蛋白和一条负链RNA组成的长螺旋状核衣壳。新城疫病毒有6组基因，分别用于编码6个病毒蛋白，即具血凝素和神经氨酸酶活性的糖蛋白(HN)、具融合功能的糖蛋白(F)、非糖基化内膜蛋白(M)、核壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)和高分子量蛋白(L)。NDV基因全长为15186nt到15198nt。

已有研究表明将NDV的cDNA克隆作人工突变、更换，或在其中插入外源序列并不会阻碍该病毒的复制，装配和释放。NDV的cDNA克隆已用于基础研究和疫苗开发。NDV的cDNA克隆可作为载体表达其它病原菌的抗原蛋白从而获得抗多种病原菌的多价疫苗。如1999年Peeters等将F基因裂解点作碱基突变使La Sota株弱毒变成了强毒(ref1)；2004年Huang等将强度和弱毒株的HN基因互换也获得了不同毒力的新毒株(ref2)。2002年，Mebatson等用肝炎病毒的S2糖蛋白抗原表位基因取代NDV的NP蛋白优势抗原表位，成功获得了既抗NDV又抗肝炎病毒的杂合病毒(ref3)；2006年，Man等将H7禽流感病毒的HA基因，插在NDV B1株的P-M基因之间也成功获得了既抗NDV又抗H7禽流感病毒的杂合病毒(ref4)。最近Abzeid等又成功将埃及当前流行的IBV S蛋白组装进重组NDV，获得了既针对原NDV又针对相应的IBV免疫保护的杂合病毒(ref5)。我国学者也用LaSota株为载体先后获得多个具二价功能的杂合病毒。如既抗NDV又抗IBDV5杂合病毒(ref6)；既抗NDV又抗H5N1的杂合病毒(ref7)；既抗NDV又抗鸡支原体TM1病毒的杂合病毒(ref8)。由于NDV只有一个血清型，因此它的遗传性能相对稳定。虽然NDV的感染性cDNA克隆在国际上早有建立，但国内基本上仅限于Latasa株，且基本局限在基础和临床的研究层面。