[发明专利]一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法

权利要求书

1.一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将新城疫病毒的NP基因、P基因和L基因分别克隆进pXJ40 载体，获得辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P和pXJ40-L；

（2）将能够在细胞中表达T7 RNA聚合酶DE3基因克隆进pXJ40 载体，获得质粒pXJ40-DE3；所述DE3基因的序列如序列SEQ ID NO：32所示；

（3）将新城疫病毒的全基因组cDNA克隆进质粒pBR322中，获得全基因组表达载体pBR322-DHN3；

所述全基因组表达载体pBR322-DHN3通过如下方法获得：

（1）建立pBR322-Base载体：人工合成依次含有HC-1、T7启动子、HDV核酶、T7终止子和HC-2的基因片段，将其插入到pBR322载体上，获得基础质粒pBR322-Base；T7启动子下游的序列HC-1对应序列表SEQ ID NO：1中的位置为15159-15192nt，HDV核酶上游的序列HC-2对应序列表SEQ ID NO：1中的位置为1-141nt，以提供重组所需的两个同源臂；

（2）构建过渡载体：所述过渡载体为质粒pBR322-PNP、质粒pBR322-PDP、质粒pBR322-LPD3；所述质粒pBR322-PNP由片段NP、MINI、P构成；所述质粒pBR322-PDP 由片段P、PD1、PD2、PD3构成；所述质粒pBR322-LPD3由片段PD3、L1、L2、L3、L4构成；

（3）构建病毒全基因组DHN3-A：将质粒pBR322-PNP、质粒pBR322-PDP、质粒pBR322-LPD3酶切得到片段PNP、PDP和LPD3，将片段PNP、PDP和LPD3通过T4链接酶连接得到病毒全基因组DHN3-A；

（4）构建带同源臂的质粒片段：以步骤（1）中的pBR322-Base载体为模板，使用含同源臂的引物A2-F和A2-R 进行扩增，得到带同源臂的质粒片段；

所述引物序列如下：

A2-F:ATCGGTAGAAGGTTCCCTCAGGTTC；

A2-R:GGTCCTATAGTGAGTCGTATTAATG；

（5）构建DHN3全基因组表达载体pBR322-DHN3；将步骤（4）中的质粒片段和步骤（3）中的病毒全基因组DHN3-A进行同源重组，得到全基因组表达载体pBR322-DHN3；

所述片段MINI在序列表SEQ ID NO：1中位置为1414-1949nt；片段PD1在序列表SEQ IDNO：1 中位置为2935-4956nt；片段PD2在序列表SEQ ID NO：1中位置为4838-6454nt；片段PD3在序列表SEQ ID NO：1中位置为6261-8283nt；片段L1在序列表SEQ ID NO：1中位置为8166-10709nt；片段L2在序列表SEQ ID NO：1中位置为10174-12299nt；片段L3在序列表SEQID NO：1中位置为12238-14433nt；片段L4在序列表SEQ ID NO：1中位置14214-15192nt；

（4）统计新城疫病毒NP基因中编码各氨基酸的密码子的使用频次，然后将编码相应氨基酸的密码子部分替换成使用频率最高的密码子，得到密码子替换后的NP基因序列，将替换后的NP基因序列替换到pBR322-DHN3质粒上，形成新的质粒pBR322-mNPDHN3；

所述步骤（4）具体为：

（1）将全基因组表达载体pBR322-DHN3使用BsiWI和XbaI双酶切，回收目的片段，目标片段长度为18141bp；BsiWI位于pBR322-DHN3的第4416-4421位，XbaI位于pBR322-DHN3的第5894-5899位；

（2）人工合成包含替换后的NP基因序列和BsiWI和XbaI双酶切位点之间序列的片段，最终得到的人工合成的片段的序列如序列SEQ ID NO：66所示；

（3）将步骤（1）的目的片段与步骤（2）人工合成的片段进行连接，得到pBR322-mNPDHN3质粒；

（5）采用步骤（1）的三种辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P和pXJ40-L，步骤（2）的质粒pXJ40-DE3和步骤（4）的质粒pBR322-mNPDHN3共转染BHK-21细胞，得到拯救病毒rDHN3-mNP；

所述新城疫病毒是指基因Ⅶ型新城疫病毒，其全基因组cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1；NP基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为1-1591nt；P基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为1925-3109nt；L基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为8166-15192nt。