[发明专利]一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质及制备方法

说明书

本发明公开了一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质及制备方法，该RNA标准物质利用噬菌体MS2衣壳蛋白能够抵抗外界环境中核糖核酸酶的降解，对其内部RNA片段起保护作的特性。采用原核表达技术表达MS2噬菌体衣壳蛋白包装汉城病毒部分片段基因，制备成稳定、基于汉城病毒G2囊膜蛋白部分片段序列为靶标的装甲RNA标准物质，适用于汉城病毒核酸检测方法的质量控制。本发明制备的汉城病毒装甲RNA标准物质，具备稳定、无生物安全危害、耐RNase酶降解等特点，便于储存、运输和使用，可对汉城病毒检测的病毒提取、RT‑PCR全过程进行质量控制，操作简单、安全有效。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质及制备方法。

背景技术

近年来，由汉城病毒引发的人感染肾综合征出血热常有报道，已经成为重要的公共卫生问题；汉城病毒(Seoul virus)属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属(Hantaan virus)。汉城病毒的主要宿主是褐家鼠，在我国，黑家鼠、黄胸鼠以及小家鼠均能携带汉城病毒。我国是受汉坦病毒危害最为严重的国家，肾综合征出血热发病人数占世界报道病例的90％以上。1981年中国河南和山西交界地区爆发汉城病毒引起的出血热疫情。而且汉城病毒是唯一呈世界性分布的汉坦病毒，在亚洲、欧洲、非洲以及南北美洲均发现汉城病毒的存在。宿主动物鼠类所携带的汉城病毒会通过粪便、尿、唾液或者血液进人破损的皮肤和粘膜、呼吸道以及消化道将病毒传播给人，或者通过蚤、螨等叮咬人导致感染。以PCR技术为代表的分子生物学技术，具有快速、灵敏、成本低等优势，同时利用PCR检测技术对检测结果进行分子流行病学分析可以得到汉城病毒的宿主流行情况，有助于对肾综合征出血热的流行进行防控。

核酸检测必须使用质控品进行质量控制，目前RNA病毒的质控品主要是病毒颗粒、裸露的RNA片段和装甲RNA。病毒颗粒包括减毒、灭活病毒或疫苗。目前，汉坦病毒有减毒活疫苗Z37株。但由于病毒制备需在高规格生物安全实验室内进行，同时由于运输保存的限制，使其作为质控标准物质。国内目前市面在售各类出血热病毒检测试剂盒一般采用合成RNA或DNA，RNA模板容易在环境中受到RNase酶降解，DNA模板无法参与核酸提取过程和反转录过程，不能对检测的全过程进行监控。目前，以噬菌体为基础的内嵌核酸病毒盔甲颗粒因其与全病毒颗粒最为接近，已成为标准物质研制的一个热点。大肠杆菌MS2噬菌体包膜蛋白与操纵子RNA序列有特异性的相互作用，在噬菌体外壳组装的同时将噬菌体基因RNA包装到包膜内，而噬菌体的外壳可以耐受RNase，因此将MS2噬菌体相应cDNA序列克隆至原核表达载体并插入特定病毒序列，经转录、翻译噬菌体衣壳蛋白组装成病毒样颗粒，具备RNase抗性便于存储和运输。

因此，一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质及制备方法亟待提出。

发明内容

为解决现有质控样品或标准物质的不足，本发明提供一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质及制备方法，具有稳定、安全、耐核糖核酸等特点，可用于汉城病毒检测的质量控制。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明的第一目的提供一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质，其特征在于，该装甲RNA的表达载体为pET32a-CP-G2质粒，质粒包含噬菌体MS2CP蛋白序列片段以及汉城病毒G2蛋白序列片段；汉城病毒装甲RNA表达载体pET32a-CP-G2转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后离心收集沉淀，获得病毒样颗粒。

本发明的第二目的提供一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质，所述装甲RNA标准物质由以下方法制备而成：

S1、噬菌体MS2 CP蛋白基因扩增：根据噬菌体MS2 CP基因序列设计一对特异性引物CP P1和CP P2，所述引物序列如下所示：