[发明专利]一株高效生物合成葡萄糖二酸的工程菌株及其应用

说明书

本发明提供了一株高效生物合成葡萄糖二酸的工程菌株及其应用，该方法通过在大肠杆菌中表达假单胞菌菌株KENGFT3(Pseudomonas synxantha strain KENGFT3)和脆弱假单胞菌P121(Pseudomonas fragi strain P121)来源的葡醛酸脱氢酶(Udh)，成功构建了从葡萄糖醛酸到葡萄糖二酸的合成途径；并将重组大肠杆菌进行细胞通透化处理，在菌体浓度为20g/L时，葡萄糖二酸的含量达到975.5mg/L±0.15。本发明提供的重组菌及其转化工艺在葡萄糖二酸的制备上具有较大优势，具有工业化应用的潜力。

技术领域

本发明涉及代谢工程技术领域，具体为一株高效生物合成葡萄糖二酸的工程菌株及其应用。

背景技术

葡萄糖二酸(Glucaric Acid,GA)是含有4个手性碳原子的一种葡萄糖衍生物，通常以手性化合物D-葡萄糖二酸的形式存在，在水溶液中会自发氧化，通常以内酯的形式存在。

葡萄糖二酸天然存在于苹果、柑橘等水果和西兰花、甘蓝等十字花科蔬菜中，在少量哺乳动物及人体内也有分泌(Chen N,Wang J,Zhao Y,et al.Microbial CellFactories(2018)17:67-80)。研究表明，葡萄糖醛酸及其衍生物，葡萄糖酸1，4-内酯(DSL)可以减少人体内胆固醇的含量和调节体内某些激素的含量，有助于改善自身免疫机制(HoK J.Biotechnology and Applied Biochemistry(2011)14:296-305)；在化学工业中，葡萄糖二酸也有非常普遍的利用价值，如合成多种生物新型缓释肥料、作为降解的各种聚合物、用来生产无毒的可生物降解的磷酸盐替代品的原材料，也可以用于防腐剂、混凝土和日常家用清洗剂的添加剂(Tae S M,sanghwal Y.Analytical Biochemistry(2009)59:183-185)，因此，葡萄糖二酸盐具有潜在的社会价值。

目前，国内外葡萄糖酸盐的制备方法以化学氧化法为主，主要包括硝酸氧化和TEMPO氧化(Qiu YY,Fang F,Du GC,et al.Chin J Biotech(2015)31:481-490)，该化学催化工艺成本高、无选择性、转化率低、产率低，且在硝酸氧化过程中可产生有毒副产物，TEMPO法虽然比较温和，但是催化剂价格昂贵且不易进行大规模生产，因此，开发一种环保、高效的葡萄糖酸盐生产方法受到研究者们的重视。

近年来，利用微生物发酵法生产葡萄糖二酸的报道越来越多，葡萄糖二酸的产量也越来越多。例如小西一诚(CA 104080918A),在大肠杆菌共同表达啤酒酵母中的肌醇-1-磷酸合酶(Inol)，小鼠肌醇加氧酶(MIOX)和丁香假单胞菌的葡醛酸脱氢酶(Udh)，构建从葡萄糖生产葡萄糖二酸的合成途径。康振等(CN 104312935A)在毕赤酵母中共同表达了毕赤酵母的肌醇-1-磷酸合酶(Inol)，肌醇加氧酶(MIOX)和臭恶假单胞菌的葡醛酸脱氢酶(Udh)，构建从葡萄糖生产葡萄糖二酸的合成途径，在其另一专利(CN 104312987A)中，在毕赤酵母中融合表达了毕赤酵母的肌醇加氧酶(MIOX)和臭恶假单胞菌的葡醛酸脱氢酶(Udh)，从而构建了从肌醇生产葡萄糖二酸的合成途径。上述都成功地获得了葡萄糖二酸，但在构建重组菌中均用到了肌醇加氧酶MIOX，该酶是生产葡萄糖二酸的限速酶，导致肌醇积累而使葡萄糖二酸产量不高，并且代谢途径太长，均需要二到三步的氧化还原反应，导致难以获得高产量的葡萄糖二酸，因此，如何简化葡萄糖二酸的合成过程、提高其产量成为葡萄糖二酸工业化生产过程中的重要研究方向。