[发明专利]一株高效生物合成葡萄糖二酸的工程菌株及其应用

权利要求书

1.一株高效生物合成葡萄糖二酸的工程菌株，其特征在于，该工程菌株同时表达两个葡醛酸脱氢酶基因(Udh)。

2.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，该工程菌株为重组大肠杆菌，该菌株共同表达了氨基酸序列SEQ ID NO.1所示序列的假单胞菌菌株KENGFT3(Pseudomonassynxantha strain KENGFT3)来源的Udh(GenBank:CP014868.1)基因和氨基酸序列SEQ IDNO.2所示序列的脆弱假单胞菌P121(Pseudomonas fragi strain P121)来源的Udh(GenBank:CP013861.1)基因。

3.如权利要求2所述的工程菌株，其特征在于，上述工程菌株的构建方法为：将假单胞菌菌株KENGFT3(Pseudomonas synxantha strain KENGFT3)和脆弱假单胞菌P121(Pseudomonas fragi strain P121)来源的葡醛酸脱氢酶(Udh)基因组为模板，扩增葡醛酸脱氢酶(Udh)基因，选用pETDuet-1为表达载体，通过酶切位点进行连接，将葡醛酸脱氢酶Udh与表达载体相连，构建重组质粒pETDuet-2×Udh，将重组质粒转化到宿主菌E.coliBL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌，即工程菌株。

4.使用权利要求1-3任一项所述的工程菌株制备葡萄糖二酸的方法，其特征在于，过程为：采用工程菌株，在经过通透化处理之后，以葡萄糖醛酸为底物，获得葡萄糖二酸。

5.如权利要求4所述的葡萄糖二酸的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)通透化处理：将重组大肠杆菌菌液于12000rpm条件下，离心5min，获得湿菌体，将湿菌体反复冻融三次或使用化学试剂处理后，即可，经处理后，可得到通透性良好的重组大肠杆菌细胞；

(2)向步骤(1)中加入反应液Ⅰ或者反应液Ⅱ，使菌体悬浮，加入葡萄糖醛酸作为反应底物，使底物终浓度为2g/L；调pH约为8.5，37℃,220rpm，培养24h；

(3)将反应液在12000rpm条件下，离心5min，分离上清Ⅰ和沉淀；将沉淀洗涤重悬，于100℃沸水浴中加热5min，将菌体中的葡萄糖二酸溶出，然后快速冷却到室温，离心，得到上清Ⅱ；将上清Ⅰ和上清Ⅱ合并，混匀，进行葡萄糖二酸的检测。

6.如权利要求5所述的葡萄糖二酸的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，反复冻融的过程为：将得到的湿菌体在液氮中下冷冻10s或将湿菌体在-20℃条件下冷冻24h以上，然后，在37℃条件下解冻，反复冻融三次；所述的化学试剂为甲苯。

7.如权利要求5所述的葡萄糖二酸的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述反应液Ⅰ由葡萄糖25g/L、酵母粉2g/L、硫酸镁0.55g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、硫酸铵3.5g/L和硫酸亚铁0.08mg/L组成。

8.如权利要求5所述的葡萄糖二酸的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述反应液Ⅱ由3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)20.9g/L、葡萄糖醛酸2g/L、葡萄糖25g/L、硫酸镁0.55g/L组成。

9.如权利要求5所述的葡萄糖二酸的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，葡萄糖二酸的检测方法采用高效液相色谱法，过程为：取1mL的发酵液，于12000rpm离心5min，然后取0.9mL上清液，加入50mg Affi-Gel进行处理，处理后的液体经0.22μm滤膜过滤，进行液相定量分析。