[发明专利]3-甾酮-1,2-脱氢酶及其基因序列和应用

说明书

本发明提供了3‑甾酮‑1,2‑脱氢酶及其基因序列和应用。一种用于表达3‑甾酮‑1,2‑脱氢酶的基因序列，基因序列为SEQ ID.4，所述基因序列用于在大肠杆菌中表达。本发明的3‑甾酮‑1,2‑脱氢酶能够高效催化雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮(4‑AD)反应生成雄甾‑1,4‑二烯‑3,17‑二酮(ADD)，具有高酶活性。另外，本发明获得了可溶性的3‑甾酮‑1,2‑脱氢酶，增加了酶的溶解度。

技术领域

本发明涉及生化领域，具体地，涉及3-甾酮-1,2-脱氢酶及其基因序列和应用。

背景技术

当甾体类化合物导入双键后，如在抗炎甾体激素药物母核的C1,2位导入双键后，能成倍地增加其抗炎作用，如醋酸可的松C1,2位上导入双键后行成的醋酸脱氢可的松，其抗炎作用提高了3-4倍，并且减少了由钠滞留而带来的副作用；还有许多临床上常用的重要甾体化合物的生产，特别是大多数具有抗炎能力的肾上腺皮质激素的生产均涉及到微生物C1,2位的脱氢反应，包括氢化泼尼松(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、帕拉米松(paramethasone)、倍他米松(batemethasone)、氟可龙(fluocortolone)、氟轻松(fluocinolone)、曲安西龙(triamcinolone)、甲基强的松龙(medrol)等。

传统的方法是应用化学法进行C1,2脱氢。尽管化学方法已用于Δ1-脱氢，将不饱和度引入醋酸氢化可的松(HA)的1,2-位时，醋酸泼尼松龙(PA)的抗炎活性提高了三到四倍。然而，由于类固醇结构的复杂性，传统的化学方法难以专一修饰甾体中间体，反应产率为80％左右，反应专一性低，副产物多，环境污染等缺陷，而且底物与产物往往结构相似不易分离等问题，使得高端甾体药物工业生产化受到限制。从4-AD转化而来的ADD是合成类固醇药物的重要前体，例如避孕药、雌激素和孕激素。利用4-AD制备ADD就一直是甾体医药行业的关键技术。高效酶法工艺制备甾体中间体，与激素药物的多步化学合成相比，效率高，产物纯度高。因此，酶促转化由于其温和的反应条件，高效率和特异性(区域选择性和立体选择性)而引起了广泛关注。

利用3-甾酮-1,2-脱氢酶(KsdD)进行酶促反应制备ADD和其它C1,2-脱氢甾体药物具有重大的应用前景。KsdD作为甾醇转化过程中的关键酶，对整个甾醇转化过程都起着很重要的作用。KsdD是一种黄素蛋白依赖型的脱氢酶，在催化反应过程中以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅因子，可以催化3-甾酮类固醇母核A环1,2位的碳碳单键(C-C)脱氢变成碳碳双键(C＝C)。如下所示，KsdD催化雄烯二酮(4-AD)的C1,2位脱氢反应生成1，4-雄烯二酮(ADD)。KsdD酶已经在很多降解甾醇的细菌中被发现，如简单节杆菌、紫红红球菌、睾丸酮假单胞菌、珊瑚诺卡氏菌、耻垢分支杆菌。由于不同来源KsdD酶，他们它们的氨基酸序列不同，蛋白酶构象存在差异性，导致底物的专一性也不同。