[发明专利]一种循环肿瘤细胞CTCs的检测鉴定方法

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞CTCs的检测鉴定方法。本发明通过物理方法捕获、形态方法识别、免疫方法验证相结合，形成一套科学合理，准确高效的检测鉴定方法，具有简单易行、准确度高的特点。在截留率、鉴定及假阳性率三个方面取得了核心技术突破性进展，开发了相应的检测设备和配套试剂，开展了临床研究，产生了重要的经济和社会效益。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞CTCs的检测鉴定方法。

背景技术

技术的不断改进和发展，CTCs的研究已成为当前肿瘤学研究的热点：不仅有助于对肿瘤转移机制的了解，而且在临床上有助于发现早期微转移、评估预后、评价治疗效果和实现个体化药物治疗。

CTCs检测首先要把血液中的肿瘤细胞和血细胞分离开来，分离方法有两大类：一类是根据细胞的特异性生物标记来富集，采用这一技术路线的主要有CellSearch系统、免疫磁性细胞分选仪（MACS）、AdnaTest癌细胞检测系统、莱尔系统等。另一类是根据CTCs和血细胞物理特性的不同进行分离富集，包括密度梯度离心法和膜滤过分离肿瘤细胞法（Isolation by size of epithelial tumor cells，ISET）。目前，已有至少53种以上基于上述理论方法的检测技术体系被报道，但没有一种方法能够将CTCs没有遗漏地检测出来。CTCs检测成为制约CTCs临床应用的瓶颈。

目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等单位，对于循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术进行产业化推广的研究，本项目为山东省重大科技创新工程项目，本项目将以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心，落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、细胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受体、孕激素受体、BCA-225、CA 125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作为CTCs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行产业化推广。

发明内容

本发明的目的在于提供一种将多种检测技术手段相结合，科学合理、准确高效的的循环肿瘤细胞CTCs的检测鉴定方法。

本发明是通过以下技术手段来实现的：

一种循环肿瘤细胞CTCs的检测鉴定方法，采用物理方法捕获、形态方法识别、免疫方法验证。

所述的物理方法捕获为：

a.采集癌症患者外周血，盛于血样容器中；

b.血样容器的下方连接一带有过滤膜的过滤器，将外周血经过滤器过滤；所述过滤膜上均匀布满直径为10-25微米的滤孔；

c．过滤完成后，进行瑞氏液染色，PBS缓冲液冲洗干净，取下滤膜，收集过滤膜上的循环肿瘤细胞CTCs。

所述的形态方法识别为：将收集的循环肿瘤细胞CTCs，放置到电子显微镜下，统计循环肿瘤细胞CTCs的数量，测量循环肿瘤细胞CTCs的尺寸，并记录循环肿瘤细胞CTCs的形态，并将其与标准的循环肿瘤细胞CTCs相对比，判断其类别。