[发明专利]抑杀沙门氏菌、产气荚膜梭菌的抗菌肽融合蛋白及其应用

说明书

本发明公开了一种抑杀沙门氏菌、产气荚膜梭菌的抗菌肽融合蛋白及其应用，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。其编码基因序列如SEQ ID No.2所示。本发明的融合蛋白对沙门氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌具有显著治疗调节作用。枯草芽孢杆菌表达的复合物通过直接的抑杀沙门氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌。融合蛋白通过模拟细胞周期蛋白A加速细胞分裂，修复受损肠道黏膜。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种抑杀沙门氏菌，产气荚膜梭菌抗菌肽融合蛋白、融合基因、表达载体及其基因工程菌。

背景技术

动物耐药菌引起的腹泻，沙门、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、链球菌等，禽腹泻、产期夹馍梭菌球虫病等各种细菌、病毒性疾病，以及动物寄生虫，真菌感染等长期以来是畜牧、禽蛋养殖中瓶颈限制问题，严重阻碍畜牧业的发展。目前畜牧养殖中，主要以抗生素添加解决临床问题，随着药物的滥用，严重破坏了动物消化道的微生态平衡，长期使用后在动物体内残留、并富集，直接影响了畜产品的品质和间接损害人类的健康，亟待需要安全、新型抗生素替代品来控制疾病和促进动物健康生长。

目前，可用于饲料添加剂领域工业化生产的菌种很多，我国农业部(2008)公布的饲用微生物添加剂有15种。其中芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌是应用最多的微生物添加剂菌种。芽孢杆菌由于稳定性好、抗逆性强、复活率高，通过与病原菌竞争营养物质，抑制病原菌；提高机体的免疫机能，并提供营养物质等作用，调节消化道健康，增强动物体的免疫功能，达到促进目标动物的生长、提高饲料的转化率的目的。

细菌素7A、7B是由某些革兰氏阳性菌产生的一类核糖体合成的抗菌肽。这些细菌素对许多革兰氏阴性菌(包括食源性致病菌，如沙门氏菌，大肠杆菌，产气荚膜梭菌等)有很强的抑制作用，因此引起了人们的极大兴趣。与大多数其他线性革兰氏阳性细菌素不同，细菌素7A和7B在水环境中高度结构化。两种肽主要是α-helical,采取类似的整体褶皱。其整体结构与肌细胞周期蛋白A惊人的相似。肌细胞周期蛋白A是一种有60个残基的肽，通过C端和n端之间的酰胺键进行环化，并具有皂苷折叠。细胞周期蛋白A与细菌素存在协同作用。因此细菌素肽7A和7B的抑菌和细胞周期调节功能具有重要作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种抗菌肽7A/7B的融合蛋白及相应的基因工程菌，用于预防和治疗家畜细菌性腹泻。

本发明的技术方案为：一种抗菌肽7A/7B的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1。

本发明的融合蛋白通过GSGDDDDK氨基酸序列链接，GSGDDDDK在肠道里被胰蛋白酶激酶切割成独立的活性结构域，利用GSG氨基酸柔性序列保护了抗菌肽7A/7B的独立折叠，DDDDK氨基酸序列保障该融合蛋白能够有效的被小肠胰蛋白酶激酶切割识别。有效地保障了抗菌肽7A/7B在肠黏膜层激活粒细胞与巨噬细胞，同时，抗菌肽7A/7B能够通过M细胞调节肠系膜淋巴结(P氏小结)内部的淋巴细胞。

本发明的抗菌肽7A/7B的基因参照NCBI－gene bank数据库的基因序列。该融合基因能实现融合基因的高效表达，带有自动分割位点GGATCCGGAGATGACGATGACAAG，通过自动分割位点的碱基片断连接抗菌肽7A/7B蛋白，表达后的融合蛋白在肠道里被胰蛋白酶激酶切割成独立的活性结构域。

编码抗菌肽7A/7B的融合蛋白的碱基序列。

进一步地，所述碱基序列如SEQ ID No.2所示。

表达载体，含有编码抗菌肽7A/7B的融合蛋白的碱基序列或SEQ ID No.2所示的碱基序列。

进一步地，所述的表达载体为分泌性表达载体。分泌性表达载体在MCS位点前面有分泌信号肽序列；分泌信号肽能高效的将重组蛋白分泌到胞外。其他载体不具备分泌等功能。