[发明专利]共载阿霉素和si-PVT1的靶向外泌体及其制备和抗骨肉瘤应用

说明书

本发明提供一种共载阿霉素和si‑PVT1的靶向外泌体及其制备和抗骨肉瘤应用，属于生物医药技术领域。所述靶向外泌体包含基因编辑具有靶向作用的外泌体颗粒，小分子药物阿霉素和基因药物si‑PVT1。本发明通过基因编辑的方法对外泌体进行人工修饰，使外泌体具有针对骨肉瘤细胞的靶向作用，同时不会损伤其他正常细胞，增强对人体的安全性；然后在其上装载小分子药物阿霉素和基因药物si‑PVT1，将这两种药物同时送至骨肉瘤细胞发挥杀伤细胞的作用。与传统的给药方式相比，本发明所提供的靶向外泌体颗粒对骨肉瘤细胞具有高度的靶向性，降低药物的毒副作用；同时可以使阿霉素和si‑PVT1这两种药物发挥协同作用，提升杀死骨肉瘤细胞作用能力，增强了抗骨肉瘤的效果。

发明领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及共载阿霉素和si-PVT1的靶向外泌体及其制备和抗骨肉瘤应用。

发明背景

骨肉瘤是一种高度恶性骨肿瘤，多发生在长骨干骺端，在儿童和青少年时期最为常见，其特点是进展迅速、容易复发和转移。目前临床治疗骨肉瘤的主要方案是“术前新辅助化疗+手术切除+术后辅助化疗”，但该治疗方法存在治疗难度大、预后不满意，患者生存率较低等问题。骨肉瘤极易发生肺转移，就诊早期出现肺转移的患者预后更差，5年生存率低于30%。尽管临床中增加化疗药物剂量、改变药物使用时间以及使用多种药物联合化疗，但对骨肉瘤患者的生存率并没有实质性的提高。此外，传统一线化疗药物阿霉素对骨肉瘤细胞的杀伤作用是有效的，但应用常规给药方法存在选择性差、毒副作用强的问题，这限制了其在临床中的使用。

外泌体是由细胞内多泡体和细胞膜融合后，释放到细胞外的一种直径约10-100nm的膜性囊泡，其中包含RNA、蛋白质、DNA片段等多种胞内物质。外泌体能在细胞间穿梭，有利于细胞间物质与信息的交换，可装载化疗药物及siRNA进行靶向治疗。外泌体作为药物载体具有天然的优势：（1）具备纳米级尺寸，在体内很容易逃过网状内皮系统的捕获；（2）具有磷脂双分子层结构，与细胞膜组成相似，对细胞膜具有较强的亲和力，便于进入细胞；（3）属于内源性囊泡，作为载体进入体内不会引起免疫反应，不会被体内的免疫系统鉴定为“非我物质”而吞噬；（4）其来源于细胞，表面含有众多跨膜蛋白，可以通过基因修饰的方式，在适当的蛋白末端加上能够靶向目标细胞的配体短肽，实现体内的靶向治疗。

诸多报道和研究能够说明，外泌体是一种理想中的药物载体，能够解决外源性载体普遍存在的免疫原性的缺点。但是，外泌体具体应用到骨肉瘤的治疗上，需要对其进行进一步修饰，并重新设计出一种新型的外泌体药物颗粒，使其具有靶向骨肉瘤细胞的能力，并且具有杀伤骨肉瘤细胞的作用。基于以上研究背景，本发明提供了一种同时装载小分子药物阿霉素和基因药物si-PVT1的靶向外泌体颗粒及其在制备用于治疗骨肉瘤药物中的应用。

发明内容

为解决现有技术不足之处，本发明的目的在于提供一种新型共载阿霉素和si-PVT1基因的靶向外泌体及其制备和用于治疗骨肉瘤药物中的应用。

为实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

首先，本发明提供共载阿霉素和si-PVT1靶向的外泌体，所述外泌体是由靶向外泌体颗粒，小分子药物阿霉素和基因药物si-PVT1组成。

进一步地，所述靶向外泌体颗粒是包含由具有靶向骨肉瘤细胞功能的短肽插入到外泌体表面的溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）的N端形成的融合蛋白，短肽插入具体位于LAMP2的信号肽和成熟序列之间；所述外泌体颗粒中具有靶向功能的短肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示；所述外泌体颗粒中具有靶向功能的短肽的核酸序列如SEQ ID NO：2所示。一方面，本发明提供共载阿霉素和si-PVT1的靶向外泌体的制备方法，按照以下步骤制备：