[发明专利]共载阿霉素和si-PVT1的靶向外泌体及其制备和抗骨肉瘤应用

权利要求书

1.共载阿霉素和si-PVT1的靶向外泌体，其特征在于，所述外泌体是由靶向外泌体颗粒，小分子药物阿霉素和基因药物si-PVT1组成；

所述靶向外泌体颗粒是包含由具有靶向骨肉瘤细胞功能的短肽插入到外泌体表面的溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）的N端形成的融合蛋白；所述靶向外泌体颗粒中具有靶向功能的短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述外泌体颗粒中具有靶向功能的短肽的核酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的短肽插入到外泌体表面的溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）的N端，具体位于LAMP2的信号肽和成熟序列之间；

所述的基因药物si-PVT1的序列为5’-GCU UGG AGG CUG AGG AGU UTT-3’。

2.共载阿霉素和si-PVT1的靶向外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法按照以下步骤制备：

（1）通过基因编辑的方法将氨基酸序列为SEQ ID NO：1的短肽，插入到外泌体表面的溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）的N端，具体位于LAMP2的信号肽和成熟序列之间，形成融合蛋白；构建pcDNA3.1(+)-hLAMP2b-Cys-CRGDKGPDC质粒，将此质粒与脂质体在5-8分钟内混匀，室温放置20-25分钟后，加入到293T细胞中，6-8小时后更换含10%FBS的培养液，24h-30h后收集上清液；

（2）将步骤（1）中的上清液进行三次离心，三次离心参数依次为：①4°C、300×g离心10min；②4°C、20,000×g离心10 min；③4°C、10,000×g离心30 min；随后收集上清液进行超速离心，超速离心参数为4°C、100,000×g超速离心70 min，然后摒弃上清液，收集沉淀球团，获得能够靶向骨肉瘤细胞的外泌体颗粒；PBS重悬外泌体颗粒后，保存于-80~-70℃；

（3）将步骤（2）中得到的靶向骨肉瘤细胞的外泌体颗粒0.2μL，基因药物si-PVT1200ng，阿霉素50μg用buffer混匀，常温下选择电压500V，持续时间15s，进行电穿孔，得到混合物；

（4）将步骤（3）中的得到的混合物通过超速离心除去游离的阿霉素和si-PVT1，即得所述共载阿霉素和si-PVT1的靶向外泌体药物；

所述步骤（3）中的 si-PVT1的序列为5’-GCU UGG AGG CUG AGG AGU UTT-3’。

3.权利要求1所述的共载阿霉素和si-PVT1的靶向外泌体或由权利要求2所述的共载阿霉素和si-PVT1的靶向外泌体的制备方法制备得到的外泌体在用于制备治疗骨肉瘤药物中的应用。