[发明专利]干细胞高效表达目的蛋白的制备方法和应用方法

说明书

本发明公开了一种干细胞高效表达目的蛋白的制备方法和应用方法，其中制备方法包括：从人体组织中分离干细胞并进行培养；结合PB转座子、EF1A启动子序列、KOZAK序列、所要表达的目的蛋白序列、T2A序列、所要表达目的蛋白序列、CD33信号肽序列、IRES序列、PURO序列和附加体系统，构建重组表达载体；将重组表达载体加入干细胞的培养悬液，采用电转染方式获得能够表达目的蛋白的干细胞。通过本发明的技术方案，可以将重组表达载体转移至干细胞中，迅速获得高表达的细胞，可以增加两种细胞因子的协同作用，使两种细胞因子同时表达，使重组表达载体质粒在干细胞内长时间存在并高效表达目的蛋白。

技术领域

本发明涉及干细胞外泌体技术领域，尤其涉及一种干细胞高效表达目的蛋白的制备方法和一种干细胞高效表达目的蛋白的应用方法。

背景技术

干细胞外泌体在国外研究已经多年，用于市场上的外泌体越来越多，而国内对于干细胞外泌体的应用也随之越来越多，但是干细胞外泌体表达浓度低应用效果一般，对目的蛋白外泌体的表达效率较低、蛋白表达量较低。

发明内容

针对上述问题中的至少之一，本发明提供了一种干细胞高效表达目的蛋白的制备方法和应用方法，通过电转染方式将重组表达载体转移至干细胞中，从而提取得到目的蛋白外泌体，采用人源启动子EF1A，在寡肽-1和碱性成纤维蛋白或其他蛋白N端融合CD33信号肽，有利于蛋白分泌，采用IRES表达原件可以增加两种细胞因子的协同作用，使两种细胞因子同时表达，采用附加体系统可以使转移的重组表达载体质粒在干细胞内长时间存在并高效表达目的蛋白，采用PURO序列筛选标记可以迅速获得高表达的细胞。

为实现上述目的，本发明提供了一种干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，包括：从人体组织中分离干细胞并进行培养；结合PB转座子、EF1A启动子序列、KOZAK序列、所要表达的目的蛋白序列、T2A序列、所要表达目的蛋白序列、CD33信号肽序列、IRES序列、PURO序列和附加体系统，构建重组表达载体；将所述重组表达载体加入所述干细胞的培养悬液，采用电转染方式获得能够表达所述目的蛋白的干细胞。

在上述技术方案中，优选地，所述重组表达载体中包括两种目的蛋白的序列，两种目的蛋白的序列分别设置于所述T2A序列的前后两侧。

在上述技术方案中，优选地，所述目的蛋白包括寡肽-1、碱性成纤维蛋白、角质蛋白、胶原蛋白、纤维连接蛋白、原纤蛋白、再生蛋白、转化因子、胰岛素样生长因子和转化因子。

在上述技术方案中，优选地，所述人体组织中分离出的所述干细胞包括间充质干细胞、脂肪干细胞和上皮干细胞，所述人体组织包括人脐带组织和脂肪组织。

在上述技术方案中，优选地，所述电转染方式的实施步骤包括：在电转染实施前1-2天，将所述干细胞转移至细胞培养瓶，使得电转染前所述干细胞的细胞汇合度为50％-70％；采用PBS缓慢冲洗所述干细胞，再吸出所述PBS，采用胰酶蛋白酶消化所述干细胞，再加入含血清的培养基中和胰酶；离心收集所述干细胞，采用PBS、hepes和无血清培养基重悬细胞，使之密度为1×10⁶～5×10⁶cell/ml；设置电转染参数为2.0kV、25uFD；将所述重组表达载体的质粒加入电转杯，根据所述干细胞种类设置所述质粒的起始浓度为10～50μg/ml；向电击杯中加入重悬后的细胞，颠转所述电击杯进行混匀；将所述电击杯放入电击槽中，进行一次脉冲电击；将电击后的细胞转移至含有培养基的孔中；晃动孔板以混匀细胞，电转24～48小时后，细胞基因瞬时表达。

在上述技术方案中，优选地，所述目的蛋白为寡肽-1和碱性成纤维蛋白时，所述重组表达载体为PB—EF1A—KOZAK—寡肽-1—T2A—碱性成纤维蛋白—CD33—IRES—PURO,附加体ORI—附加体EBNA1。