[发明专利]干细胞高效表达目的蛋白的制备方法和应用方法

权利要求书

1.一种干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，其特征在于，包括：

从人体组织中分离干细胞并进行培养；

结合PB转座子、EF1A启动子序列、KOZAK序列、所要表达的目的蛋白序列、T2A序列、所要表达目的蛋白序列、CD33信号肽序列、IRES序列、PURO序列和附加体系统，构建重组表达载体；

将所述重组表达载体加入所述干细胞的培养悬液，采用电转染方式获得能够表达所述目的蛋白的干细胞。

2.根据权利要求1所述的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，其特征在于，所述重组表达载体中包括两种目的蛋白的序列，两种目的蛋白的序列分别设置于所述T2A序列的前后两侧。

3.根据权利要求1或2所述的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，其特征在于，所述目的蛋白包括寡肽-1、碱性成纤维蛋白、角质蛋白、胶原蛋白、纤维连接蛋白、原纤蛋白、再生蛋白、转化因子、胰岛素样生长因子和转化因子。

4.根据权利要求1所述的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，其特征在于，所述人体组织中分离出的所述干细胞包括间充质干细胞、脂肪干细胞和上皮干细胞，所述人体组织包括人脐带组织和脂肪组织。

5.根据权利要求1所述的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，其特征在于，所述电转染方式的实施步骤包括：

在电转染实施前1-2天，将所述干细胞转移至细胞培养瓶，使得电转染前所述干细胞的细胞汇合度为50％-70％；

采用PBS缓慢冲洗所述干细胞，再吸出所述PBS，采用胰酶蛋白酶消化所述干细胞，再加入含血清的培养基中和胰酶；

离心收集所述干细胞，采用PBS、hepes和无血清培养基重悬细胞，使之密度为1×10⁶～5×10⁶cell/ml；

设置电转染参数为2.0kV、25uFD；

将线性化的所述重组表达载体的质粒加入电转杯，根据所述干细胞种类设置所述质粒的起始浓度为10～50μg/ml；

向电击杯中加入重悬后的细胞，颠转所述电击杯进行混匀；

将所述电击杯放入电击槽中，进行一次脉冲电击；

将电击后的细胞转移至含有培养基的孔中；

晃动孔板以混匀细胞，电转24～48小时后，细胞基因瞬时表达。

6.根据权利要求3所述的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，其特征在于，所述目的蛋白为寡肽-1和碱性成纤维蛋白时，所述重组表达载体为PB—EF1A—KOZAK—寡肽-1—T2A—碱性成纤维蛋白—CD33—IRES—PURO,附加体ORI—附加体EBNA1。

7.根据权利要求3所述的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，其特征在于，所述目的蛋白为寡肽-1和角质蛋白时，所述重组表达载体为PB—EF1A—KOZAK—寡肽-1—T2A—角质蛋白—CD33—IRES—PURO,附加体ORI—附加体EBNA1。

8.根据权利要求4所述的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，其特征在于，从人脐带组织中分离间充质干细胞的步骤包括：

分离得到人脐带组织块，并利用胰酶消化5-10分钟；

收集组织悬液并离心，弃掉上清液，将所述组织块贴放到平皿中；

加入DMEM细胞培养基，定期半量换液；

待细胞长满平皿后，去除所述组织块；

利用胰酶消化处理后将所述平皿上的原代细胞转移至T75培养瓶中；

待细胞长满培养瓶并传代至2-3代，得到间充质干细胞。