[发明专利]一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法

说明书

本发明涉及一种测定可溶性总蛋白中14‑3‑3蛋白表达水平的方法，属于电化学分析技术领域。本发明选用导电性良好的碳浆电极，经多壁碳纳米管/纳米金(MWCNTs/AuNPs)复合物修饰丝网印刷碳电极表面，把14‑3‑3蛋白抗体固定于印刷电极表面上，再加入14‑3‑3蛋白检测样品；由于该抗体与14‑3‑3蛋白特异性结合，碳电极能快速识别并捕获样品中的14‑3‑3蛋白，之后再加入14‑3‑3蛋白信号抗体探针，探针上的14‑3‑3抗体能快速识别结合碳电极捕获的14‑3‑3蛋白，制得电流型免疫传感器。信号抗体探针上的CAT酶催化H₂O₂产生还原氧化反应，通过电化学分析工作站检测该反应的信号电流峰值，可快速实现对14‑3‑3蛋白表达水平检测。该检测方法具有灵敏度高、检测限低、选择性和重复性好等优点，可用于14‑3‑3蛋白表达水平的定量检测。

技术领域

本发明属于电化学分析技术领域，具体的说，涉及一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋 白表达水平的电化学方法。

背景技术

14-3-3蛋白家族是一组高度保守的可溶性酸性蛋白质，分子量在28～33kD之间，广泛 分布于各种真核生物之中。该蛋白能够特异地结合含有磷酸化丝氨酸或苏氨酸的肽段，参与 多种信号转导途径。14-3-3蛋白调节着许多重要细胞生命活动，如：新陈代谢、细胞周期、 细胞生长发育、细胞的存活和凋亡以及基因转录，该蛋白家族异常与疾病的发生密切相关， 尤其是14-3-3蛋白在脑脊液中的分布与一些神经系统疾病密切相关。14-3-3蛋白已成为一些 疾病的临床诊断指标，其作为疾病治疗的靶点也在研究之中。

14-3-3蛋白主要分布于细胞质、细胞核、线粒体基质、叶绿体基质和类囊体膜。在植物 中14-3-3蛋白对碳和氮代谢有广泛的调控作用，14-3-3蛋白通过与碳代谢途径关键酶如蔗糖 磷酸合酶、6-磷酸果糖激酶/果糖二磷酸激酶、葡1萄糖-1-磷酸腺苷转移酶、甘油醛3-磷酸 脱氢酶、淀粉合成酶、脂肪氧化酶互作影响这些酶的活性，从而实现对植物碳代谢的调控， 影响光合产物的分配、淀粉的积累及脂肪的氧化等。因此，检测14-3-3蛋白表达水平具有 重要意义。

目前在科研和诊断中检测蛋白表达水平多采用Western Blot分析技术，但这种方法都存 在着自身的不足，Western Blot分析技术在使用过程中运行成本较高，无论是仪器还是耗材 的成本都不低；同时，Western Blot分析方法在操作时往往存在操作繁琐、检测限低等不 足。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的电化学方法， 该方法具有选择性好、样品不需预处理、可实现连续在线监测、测定成本远低于大型分析仪 器等优点，可以快速、准确的检测14-3-3蛋白表达水平。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

所述的测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法，包括以下步骤：

(1)碳浆印刷电极以碳浆为工作电极，氯化银为参比电极，碳浆为对电极的印刷电极；

(2)依次把多壁碳纳米管/纳米金(MWCNTs/AuNPs)、14-3-3蛋白抗体组装到碳浆印刷 电极的工作电极上，制备的SPCE│MWCNTs-Au-Anti-14-3-3电极用牛血清蛋白BSA封闭30分钟，除去非特异性结合位点，制备得到14-3-3蛋白捕获抗体探针；

(3)将待测蛋白样品滴加到14-3-3蛋白捕获抗体探针上，使14-3-3蛋白与抗体充分结 合后，用电极洗液和去离子水交替冲洗，以洗去非特异性结合的杂蛋白；

(4)在工作电极上滴加14-3-3蛋白信号抗体探针结合后，用电极洗液和去离子水交替 冲洗，制得电流型免疫传感器；