[发明专利]一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法

权利要求书

1.一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）碳浆印刷电极以碳浆为工作电极，氯化银为参比电极，碳浆为对电极的印刷电极；

（2）依次把多壁碳纳米管/纳米金(MWCNTs/AuNPs)、14-3-3蛋白抗体组装到碳浆印刷电极的工作电极上，制备的SPCE│MWCNTs-Au-Anti-14-3-3电极用牛血清蛋白BSA封闭非特异性结合位点，制备得到14-3-3蛋白捕获抗体探针；

（3）将待测蛋白样品滴加到14-3-3蛋白捕获抗体探针上，使14-3-3蛋白与抗体充分结合后，用电极洗液和去离子水交替冲洗，以洗去非特异性结合的杂蛋白；

（4）在工作电极上滴加14-3-3蛋白信号抗体探针结合后，用电极洗液和去离子水交替冲洗，制得电流型免疫传感器；

（5）在电流型免疫传感器上滴加H₂O₂反应液，使用循环伏安法测定电流值大小；将测得的电流值代入电流峰值与14-3-3蛋白浓度的线性关系式y=0.1297x+0.417中，求得14-3-3的蛋白浓度。

2.根据权利要求1所述的一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述14-3-3蛋白捕获抗体探针的滴加量为5μl，浓度为0.6μg/μL；牛血清蛋白的滴加量为5μl，质量百分比浓度为1%。

3.根据权利要求1或2所述的一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法，其特征在于：步骤（3）中，待测蛋白样品用量体积总量为5μL，蛋白与抗体的结合时间为室温下1小时。

4.根据权利要求1-3任一项所述的一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述14-3-3蛋白信号抗体探针的滴加量为5μl，浓度为0.016μg/μL，结合时间1h。

5.根据权利要求1-4任一项所述的一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法，其特征在于：步骤（5）中，所用反应液的含量及用量为：100μL 40mM H₂O₂溶液；H₂O₂反应液反应1min后进行循环伏安法测定，循环伏安扫描电压范围为-0.3-0.6V，扫速为500mV/s。

6.根据权利要求1所述的一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法，其特征在于：电极洗液为pH7.2的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液中含0.1mmol/L NaCl和质量百分比浓度为1%的Tween 20。

7.根据权利要求1或2所述的一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法，其特征在于：14-3-3蛋白捕获抗体探针的具体制备步骤如下：

在碳浆印刷电极的工作电极表面滴涂10µL多壁碳纳米管/纳米金（MWNTP-Au）复合物，室温下凉干；再将电极浸入巯基乙酸的乙醇溶液(TGA，25mmol /L)中，4℃保存12小时后，依次用乙醇和电极洗液清洗，氮气吹干待用；再将10µL EDC/NHS(2mmol /L: 5mmol /L) 滴涂到电极表面，保持30分钟，用以活化电极表面的羧基，电极洗液洗涤3次；再将5µL捕获抗体{Anti-14-3-3}滴到电极上，温育30分钟；制备的SPCE│MWCNTs-Au-Anti-14-3-3电极用1.0%BSA封闭30分钟，除去非特异性吸附位点，形成14-3-3蛋白捕获抗体探针。