[发明专利]一种乳杆菌GM_1及其选育方法

权利要求书

1.一种乳杆菌GM_1的选育方法，其特征在于，所述乳杆菌GM_1的选育方法包括以下步骤：

步骤一，菌株活化培养：将待选育的乳杆菌菌株接种于MRS液体培养基中，并在温度37℃与有氧的条件下暗中活化培养24h，传代培养3代后，将得到的培养液划线接种于MRS平板培养基上，并置于温度37℃的条件下培养48h；

步骤二，从MRS平板培养基上挑选一个单菌落作为出发菌株，并接种于5ml MRS液体培养基中，于37℃静置培养24～48h，传代培养3代；再按3％的接种量接种于MRS液体培养基中，于37℃静置培养24～36h得活化的菌液，冻干保藏；

步骤三，制备接种液：将步骤二得到的乳杆菌单菌落置于5～8mL的生理盐水中混合均匀得到乳杆菌悬液；用LSM培养液稀释菌悬液至在波长600～800nm条件下OD值为0.15～0.2，得到乳杆菌接种液；

步骤四，用无菌离心管中吸取乳杆菌接种液2.5ml，加入亚硝基胍母液和灭菌磷酸缓冲液定容至5.0ml，将离心管置于摇床上，温度为36.5～37℃混合均匀，5000r/min离心6min，弃去上清液，洗涤，稀释，得亚硝基胍处理过的菌液；

步骤五，将亚硝基胍处理过的菌液涂布于MRS平板培养基上于37℃培养24h后，挑选单菌落接种于液体培养基中，于37℃培养24h，得到乳杆菌突变单体，每个处理的新种质一起组成突变群体；

步骤六，将步骤五得到的突变单体在MRS平板培养基上划线，于37℃培养24～36h，挑选出形态规则、特征明显、菌落明显大于其它菌落的菌落，即可得到新的、快速生长的乳杆菌GM_1；

步骤七，将步骤六选育得到的乳杆菌GM_1接种于MRS培养基中培养后，进行冷冻离心，得到沉淀；往沉淀中加入冻干保护剂后进行冻干，取出后在无菌环境下进行粉碎至粉状，得到选育后的乳杆菌GM_1冻干粉。

2.如权利要求1所述的乳杆菌GM_1的选育方法，其特征在于，步骤一中，所述MRS液体培养基由20g/L葡萄糖、12g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L无水乙酸钠、2g/L磷酸氢二钾、1.5g/L柠檬酸二胺、0.5ml/L吐温-80、0.25g/L硫酸锰和浓度为0.25～1.0mol/L的KH₂PO₄缓冲液组成。

3.如权利要求2所述的乳杆菌GM_1的选育方法，其特征在于，所述MRS液体培养基的制备方法为：

(1)将葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、无水乙酸钠、磷酸氢二钾、柠檬酸二胺、吐温-80、硫酸锰混合；

(2)在混合液中加入KH₂PO₄缓冲液，定容至1000mL；

(3)用0.1mol/L的NaOH调节pH至7；

(4)在120℃条件下灭菌10min，得到MRS液体培养基。

4.如权利要求1所述的乳杆菌GM_1的选育方法，其特征在于，步骤一中，所述MRS平板培养基是在MRS液体培养基基础上添加25.0g/L琼脂，高压灭菌20～30min。

5.如权利要求1所述的乳杆菌GM_1的选育方法，其特征在于，步骤四中，所述稀释的方法为：弃去上清液后，用灭菌磷酸缓冲液洗涤菌体2～3次后，加入等体积的灭菌磷酸缓冲液悬浮菌体，适当稀释。

6.如权利要求1所述的乳杆菌GM_1的选育方法，其特征在于，步骤五中，所述乳杆菌突变群体添加20％的灭菌甘油，于-80℃长期保存。

7.如权利要求1所述的乳杆菌GM_1的选育方法，其特征在于，步骤六中，所述在相同培养时间内菌落大小是未经诱变的菌落大小的2倍以上。

8.如权利要求1所述的乳杆菌GM_1的选育方法，其特征在于，步骤七中，所述乳杆菌GM_1在37℃的环境下培养48h后，在4℃、6000rpm的环境下进行冷冻离心；并于冷冻干燥机里冻干48小时后粉碎。