[发明专利]一种贴壁细胞核蛋白的分离方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种贴壁细胞核蛋白的分离方法，包括以下步骤：1)贴壁细胞培养，2)在贴壁状态下用A液破碎并去除细胞核以外的细胞结构或成分使得瓶壁上只剩下贴壁的细胞核，3)在悬液状态或贴壁状态下用B液破碎细胞核，4)离心，得核蛋白。本发明提供的分离方法简单、快速、更有效，检测灵敏度更高，整个细胞核分离、纯化过程耗时不到1.5小时，可应用于试剂盒中。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种贴壁细胞核蛋白的分离方法，可应用于对细胞核及核蛋白等进行简单、有效的分离，并可进一步应用于核蛋白的鉴定。

背景技术

在生化与分子生物学、细胞生物学和发育生物学等的研究中，对各信号通路及相关关键分子的研究至关重要。所有信号通路都涉及到信息从细胞外到细胞核内的传递，以实现对特定基因的表达调控。例如，从细胞质到细胞核的信息传递，会有特定的分子或修饰后的分子(例如磷酸化的蛋白)从细胞质中迁移到细胞核内，使得其细胞核内的浓度显著升高，从而调控后续相关基因的表达。对这些特定分子在细胞核内浓度变化的检测，是信号通路研究的重要内容和方法之一。

对特定分子在细胞核内浓度的检测，涉及到这些分子的分离和纯化，首先要实现的是细胞核和核蛋白的分离和纯化。目前，细胞核分离的常用方法主要有细胞破碎方法和提取液法两类，前者包括研磨法、超声破碎法、酸解法和酶解法等，后者使用各种表面活性剂(例如NP-40、TritonX-100、Tween20等)来破碎细胞。细胞核纯化的方法主要包括过滤法、差速离心法、不连续的渗透梯度、连续的渗透/蔗糖梯度等。其中，通过表面活性剂处理悬液状态下的细胞及细胞核是较传统的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、有效的方法，能够将细胞核和核蛋白从贴壁细胞上分离出来，通过表面活性剂处理贴壁状态下的细胞及细胞核，提高细胞核及核蛋白丰度的目的，能用于后续的核蛋白鉴定等的研究。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种贴壁细胞核蛋白的分离方法，包括以下步骤：

1)待细胞培养贴壁铺展至面积占培养皿底面积70-90％时吸弃培养液，用预冷的PBS清洗贴壁细胞3遍；

2)每10⁷个细胞加入500μL预冷的A液，A液为用PBS配制的0.1％-2％表面活性剂溶液，处理之前每1mLA液加18μLPMSF、1μL蛋白质酶抑制剂、根据实验目的需要添加1μL其它蛋白酶抑制剂，冰上处理10min；

3)吸弃A液，用预冷的A液再轻轻清洗细胞核3遍；

4)采用悬液状态下破碎细胞核：用预冷A液温和清洗和摇晃培养皿，收集细胞核于预冷离心管中；低温低速离心10min，弃去上清；向沉淀中加入100μL预冷的B液，以涡旋震荡仪剧烈震荡20秒，震荡3次，B液为用PBS配制的0.1％-2％去污剂溶液，处理之前每1mL B液加18μL PMSF、1μL蛋白质酶抑制剂、根据实验目的需要添加1μL其它蛋白酶抑制剂；

或者，采用贴壁状态下破碎细胞核：瓶中加入1mL预冷的B液，处理之前每1mL B液加18μL PMSF、1μL蛋白质酶抑制剂、根据实验目的需要添加1μL其它蛋白酶抑制剂，在冰上反复吹打，收集上清；

5)低温高速离心20min，立即收集上清，即为核蛋白，置于-80℃冰箱保存。

进一步地，当采用贴壁状态下破碎细胞核时，浓缩收集核蛋白的溶液。

进一步地，所述的表面活性剂为NP-40、TritonX-100或Tween20。

进一步地，所述的去污剂为SDS、EDTA。