[发明专利]生菜作为宿主在表达人乳头瘤病毒蛋白或制备人宫颈癌疫苗中的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及利用植物来表达人宫颈癌疫苗(即人宫颈癌病毒(Human Papillomaviruses，HPV)蛋白)。本发明利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的有效表达平台，利用简单以及有效的农杆菌介导的真空渗透方法来表达人宫颈癌疫苗。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4d后就可以收集。利用SDS‑PAGE法确定重组人宫颈癌疫苗蛋白成功表达。表达的重组蛋白通过自组装成病毒样粒子后免疫新西兰白兔，获得的血清通过酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)和假病毒颗粒中和试验证明植物表达的人宫颈癌疫苗具有生物学活性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及生菜作为宿主在表达人乳头瘤病毒蛋白或制备人宫颈癌疫苗中的应用。

背景技术

宫颈癌疫苗，又称为HPV疫苗，是一种预防宫颈癌发病的疫苗。宫颈癌主要由感染人乳头瘤病毒(HPV)引起，该疫苗通过预防HPV病毒感染，进而有效预防了宫颈癌的发病，可防止人体感染疫苗所涵盖的人乳头状瘤病毒亚型变异。研究发现99.7％的子宫颈癌都是因感染HPV造成的，HPV也可以引发其他相对少见的癌症，如阴茎癌、喉癌、肺癌和肛门癌等。HPV的主要途径是性或皮肤与皮肤接触传播。

人乳头瘤病毒是是乳头瘤病毒家族中的一种，简称HPV。目前已知有100多种不同类型的HPV，其中大部分HPV类型被视为“低风险”，与宫颈癌并无关联。但是，有14种HPV类型被列为“高风险”，因为已经证实它们会导致几乎所有的宫颈癌。其中，两种风险最高的病毒株HPV-16型和HPV-18型可导致约70％的宫颈癌病例。HPV感染现在国际上不论从流行病学还是临床数据方面均已达成共识，即HPV是引起宫颈癌的必要条件。第一位阐明HPV是引起宫颈癌关键因素的德国科学家楚尔-豪森也于2008年被授予了诺贝尔医学生理学奖。在其研究的基础上，科学家们研发了HPV预防性疫苗来预防宫颈癌的发生。

目前全球上市的三种HPV疫苗分别默沙东公司的Gardasil(四价和九价两种)和葛兰素史克的Cervarix。这两种疫苗已经在100多个国家和地区上市，全球使用达数千万例。2006年，默沙东公司研发出全球第一个HPV四价疫苗“佳达修”(Gardasil)，它可用于预防6、11、16、18四种HPV病毒亚型所导致的多种疾病，并通过优先审批在美国上市。

随后，葛兰素史克公司也生产出二价疫苗“卉妍康”(Cervarix)(即在我国上市希瑞适)，可以预防16、18两种HPV病毒，由这两种病毒引起的宫颈癌占了总数的70％。2014年，默沙东推出新一代佳达修9价(也称为加卫苗9)，包含的HPV型别在原有四价的基础上新增了31、33、45、52和58五种HPV病毒亚型，对宫颈癌的预防率可以达到90％，即所谓的九价疫苗。截至2016年6月，佳达修九价已在130多个国家和地区获批上市。

植物作为药物蛋白质的表达和生产系统，已经研究了近三十年。除了低成本和产量高等的优点外，基于植物的表达系统还降低了人和动物病原体从产生蛋白质的过程中传播到人类的风险。此外，植物真核蛋白内膜表达系统和分泌途径类似于哺乳动物细胞。植物表达系统可大量生产大分子量以及多亚基的药物蛋白质，且优于原核生物表达系统，比如大肠杆菌表达系统。如需要翻译后修饰的，糖基化的蛋白，以及需要组装的其它药物蛋白，其不能用原核系统实现。利用植物生产的药用蛋白作为生物试剂已经商业化。2012年批准的Elelyso是在美国上市的第一个也是迄今唯一一个转基因植物生产的新药。主要成分是葡糖脑苷脂酶，用于治疗1型戈谢病，而这种蛋白是利用胡萝卜生产的。在过去十年中，人们对药物蛋白质的需求急剧增加，所以FDA批准用于临床试验的植物药用蛋白质的数量也在不断增加。