[发明专利]用于肝癌早期诊断的检测岩藻糖基化载脂蛋白H的ELISA试剂盒

权利要求书

1.一种用于肝癌早期诊断的检测岩藻糖基化载脂蛋白H的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的ELISA试剂盒包括：

(A)岩藻糖基化载脂蛋白H标准品；

(B)载脂蛋白H单克隆抗体包被的酶标板；

(C)辣根过氧化物酶标记的小扁豆凝集素；

(D)标准品稀释液、样品稀释液、HRP-LCA稀释液、洗涤液、封闭液、TMB显色液以及终止液。

2.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的检测岩藻糖基化载脂蛋白H的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的岩藻糖基化载脂蛋白H标准品的制备方法为：称取15μg载脂蛋白H标准品，溶于1mL浓度为0.01mol/L且pH为7.4的PBS缓冲液，吸取600μL加入到小扁豆凝集素亲和吸附离心管中，室温静置10min，吸取1.2mL清洗液加入离心管中，3000r室温下离心20s，弃去离心液体，加入600μL洗脱液到离心管，3000r室温下离心收集离心柱外管液体，即为所需要的岩藻糖基化载脂蛋白H标准品。

3.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的检测岩藻糖基化载脂蛋白H的ELISA试剂盒，其特征在于：所述载脂蛋白H单克隆抗体包被的酶标板的制备过程为：取1mg/mL的载脂蛋白H单克隆抗体用包被液以1:800的比例稀释后加入酶标板各孔，每孔100μL，4℃包被过夜；随后甩去酶标板孔内液体，采用洗涤液PBST浸泡3min，反复洗涤3次，拍干酶标板内液体后用封闭液，100μL孔，37℃封闭60min，再次洗板3次，甩干后晾干，即获得载脂蛋白H单克隆抗体包被的酶标板。

4.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的检测岩藻糖基化载脂蛋白H的ELISA试剂盒，其特征在于：所述辣根过氧化物酶标记的小扁豆凝集素的制备方法为：称取5mg辣根过氧化物酶溶解于蒸馏水中后定容至0.5mL，随后加入0.5mL新配的0.1mol/L过碘酸钠溶液中，搅拌混匀，4℃下避光30min；将上述溶液装入透析袋，对1mmol/L pH 4.4醋酸钠缓冲液透析，避光，4℃过夜；加20μL 0.2mol/L，pH 9.5碳酸盐缓冲液，将溶液pH值调至9.0-9.5，然后立即加入5mg小扁豆凝集素，轻轻搅拌，4℃避光过夜；加入0.2mL新配的4mg/mL NaBH₄，搅拌混匀，4℃放置2h；将上述溶液装入透析袋中，对0.15mol/L pH7.4的PBS透析，避光，4℃过夜；在搅拌的情况下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，避光4℃放置1h；3000r/min离心30min，然后弃上清；沉淀物用半饱和硫酸铵洗2次，最后将沉淀物溶解于0.15mol/L pH 7.4PBS中，将所得的溶液装入透析袋中，对0.15mol/L pH 7.4PBS缓冲盐水透析，除盐换液3次，最后1次4℃过夜，去除铵离子；10000r/min离心30min去除沉淀，上清液则为所述辣根过氧化物酶标记的小扁豆凝集素，分装冰冻保存于-20℃。

5.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的检测岩藻糖基化载脂蛋白H的ELISA试剂盒，其特征在于：所述标准品稀释液为PBS缓冲液，且其pH为7.4，浓度为0.01mol/L。

6.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的检测岩藻糖基化载脂蛋白H的ELISA试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液为50mmol/L，pH 8.0的Tris-HCl溶液。

7.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的检测岩藻糖基化载脂蛋白H的ELISA试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为PBST缓冲液；所述封闭液为含1％BSA的PBST缓冲液，过滤除菌，4℃保存。

8.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的检测岩藻糖基化载脂蛋白H的ELISA试剂盒，其特征在于：所述TMB显色液为磷酸盐-枸橼酸缓冲液。

9.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的检测岩藻糖基化载脂蛋白H的ELISA试剂盒，其特征在于：所述终止液为将90mL蒸馏水，逐渐滴加入10mL 98％浓硫酸中所配制而成的溶液。

10.利用权利要求1-9任意一项所述的ELISA试剂盒定量检测岩藻糖基化载脂蛋白H的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)分别配制浓度为0ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL的Fc-APOH标准品；

2)在载脂蛋白H单克隆抗体包被的酶标板的微孔中加待测样品，其中，采用样品稀释液1:1000稀释待检样品至适当浓度，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照，还有步骤1)中不同溶度的标准品，均100μL/孔，振荡混匀，37℃湿盒温育60min，洗板同上；

3)加酶标小扁豆凝集素：将辣根过氧化物酶标记小扁豆凝集素1:200稀释，100μL/孔，需新鲜配制，室温30min，洗板同上；

4)显色：加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光孵育15min；

5)终止：各孔加50μL终止液终止反应，混匀后10min内在450nm波长处测定吸光度值；

6)制作标准曲线：测定浓度分为0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml的Fc-APOH标准品的OD值作Fc-APOH的蛋白标准曲线，其中以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标；

7)根据标准曲线计算待测样品Fc-APOH浓度。