[发明专利]胃癌原代细胞的培养基及培养方法

说明书

本发明提供了一种实现胃癌原代细胞体外快速扩增的培养基和培养方法。本发明的胃癌原代细胞培养基包含初始培养基、Rho蛋白酶抑制剂、抗生素、胰岛素、非必需氨基酸、氢化可的松、霍乱毒素、谷氨酰胺、胎牛血清、以及选自B27添加剂和N2添加剂中的至少一种的添加剂。通过使用本发明的胃癌原代细胞培养基，采用条件重编程的培养技术，能够实现胃癌原代细胞的有效快速扩增，这样扩增得到的细胞保持了病人的病理特性，提高了胃癌原代细胞的培养成功率和细胞扩增速率，可以为患者的个性化治疗提供研究基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于胃癌原代细胞的快速扩增的培养基及培养方法，及其在药物的疗效评估和筛选中的应用。

背景技术

胃癌是最常见的恶性消化道肿瘤，早期胃癌患者无明显症状，因此多数胃癌患者确诊时已发展至中晚期。胃癌细胞对化疗药物敏感性较差，因此其化疗效果差，导致五年生存率低。近年来，随着科学技术的发展，胃癌诊疗技术不断提高，尤其是手术、内镜技术、放化疗、靶向治疗等综合治疗方式的进步，胃癌的治疗效果有所提升，但对于晚期及伴转移病灶的胃癌患者，综合治疗的预后仍不理想。流行病学调查分析显示，在我国胃癌发病例数和死亡例数分别占全球胃癌发病和死亡的42.6％和45.0％，在全球183个国家中位于发病率第5位、死亡率第6位。胃癌仍是严重危害中国居民健康的主要疾病之一，降低我国胃癌的发病率和死亡率越来越成为我们必须直面的重大公共卫生问题。

现有的体外培养的胃癌细胞系主要通过将正常细胞长期培养而自发永生化或者转染促使正常细胞永生化的癌基因获得。传统方法建立的细胞系依然是细胞、分子和癌生物学研究的主要支柱。但是，这些方法改变了细胞的遗传背景，长期培养的细胞系，也容易造成基因组不稳定，可能导致肿瘤细胞系的表型和体内肿瘤细胞发生人为的改变。这些细胞系中通常缺乏原发肿瘤的复杂异质性，从而限制了这些细胞系对于预测肿瘤细胞反应的应用，影响胃癌的科学研究和药物研发的准确性。另外，从胃癌组织获得的细胞培养成癌细胞的过程中，常规培养方法较难得到癌细胞，培养过程中存在容易被成纤维细胞干扰，形成的克隆无法传代等问题，限制了人胃癌原代细胞的应用。

2017年Xuefeng Liu等人使用辐照的小鼠成纤维细胞和Rho相关激酶抑制剂(Y-27632)来扩增上皮来源的细胞，该体系具有无需基因操作就能实现上皮来源细胞无限增长的能力(Xuefeng Liu等，Conditional reprogramming and long-term expansion ofnormal and tumor cells from human biospecimens.Nat.Protoc.2017,12,439)。但是，Xuefeng Liu等人建立的方法的培养周期较长，不能实现细胞的快速扩增，限制了该技术的应用。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于在体外快速扩增胃癌原代细胞的培养基及培养方法。

本发明的一个方面在于提供一种胃癌原代细胞的培养基，所述培养基包含初始培养基、Rho蛋白酶抑制剂、抗生素、胰岛素、非必需氨基酸、氢化可的松、霍乱毒素、谷氨酰胺、胎牛血清(FBS)、以及选自B27添加剂和N2添加剂中的至少一种的添加剂。

所述初始培养基选自DMEM/F12、DMEM、F12或RPMI-1640。

其中，选自B27添加剂和N2添加剂中的至少一种的添加剂优选为B27添加剂、或者B27添加剂和N2添加剂。

(1)Rho蛋白激酶抑制剂选自Y27632、羟基法舒地尔和GSK429286A中的一种或多种，当选自Y27632时，浓度范围为2.5～40μM，优选为10～20μM；当选自羟基法舒地尔时，浓度范围为2～32μM，优选为4～16μM；当选自GSK429286A时，浓度范围为2～32μM，优选为4～16μM；