[发明专利]一种制备丹参无菌苗的方法

说明书

本发明涉及丹参种子消毒领域，具体是一种制备丹参无菌苗的方法。包括以下步骤：（1）将丹参种子用4wt%次氯酸钠浸泡5分钟，捞出，备用；（2）将步骤（1）得到的丹参种子置于30wt%过氧化氢浸泡5分钟，捞出，备用；（3）将步骤（2）得到的丹参种子用无菌水冲洗3‑5遍，接种于1/2MS培养基上，培养15‑20天即可得到转基因试验所用的无菌苗。与目前常用的采用田间丹参叶片经消毒和组织培养培育再生苗的方法相比，本发明解决了田间叶片培育受气候限制的问题，可以随时进行无菌苗制备，叶片经组织培养再生无菌苗周期长，一般需2个月以上，本发明用种子种植仅需15‑20天。

技术领域

本发明涉及丹参种子消毒领域，具体是一种制备丹参无菌苗的方法。

背景技术

丹参是著名的传统中草药之一，广泛应用于预防和治疗高血脂，心脑血管，和急性缺血性中风等疾病，具有抗氧化，抗肿瘤，抗病毒，消炎抗菌，调控血糖血脂等多种药理活性。利用转基因技术创建药效成分含量高、抗逆性好、经济产量高的丹参新种质材料是目前丹参研究和利用的重要技术。

制备无菌苗是丹参转基因技术的第一步，是前提步骤，决定了丹参转基因的成败。目前常用的丹参无菌苗制备有两种方法：第一种是用大田带叶柄的丹参叶片消毒，经过组织培养培育无菌苗；具体方法是取带叶柄叶片用流水冲洗，转移至超净工作台中用酒精消毒，在次氯酸钠溶液中浸泡,然后用无菌水冲洗去除次氯酸钠溶液，无菌滤纸吸干水后将叶片切成小块，接种于1/2MS培养诱导实验所需要的无菌组培苗。这种方法存在的问题有：田间叶片经组织培养成苗周期长，一般需1个月至2个月；田间叶片取材受环境影响较大，田间丹参收获后无法取叶片；田间培育丹参叶片费时费力；田间取的叶片较大，消毒难度大。目前文献报道多是采用第一种方法。

第二种方法是用丹参种子消毒后，种于MS培养基上培育无菌苗。具体方法是，选取饱满的丹参种子，用2％-4％的次氯酸钠浸泡10min，然后用无菌水冲洗3-5遍，种于1/2MS培养基上培育成无菌苗。这种方法较第一种方法的优点是不受外界环境限制，任何时候都可以制备。存在的问题是消毒不彻底，容易污染，种子发芽慢，发芽时间较长，发芽时间长达7-10天。

为了解决这个问题，发明人曾尝试加大次氯酸钠浓度和浸泡时间，但是加大浓度和时间解决了消毒问题，却降低了丹参种子发芽率，发芽时间也变长了。

发明内容

本发明为了解决丹参种子消毒不彻底对其发芽率的影响，提供了一种制备丹参无菌苗的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种制备丹参无菌苗的方法，包括以下步骤：

(1)将丹参种子用4wt％次氯酸钠浸泡5分钟，捞出，备用；

(2)将步骤(1)得到的丹参种子置于30wt％过氧化氢浸泡5分钟，捞出，备用；

(3)将步骤(2)得到的丹参种子用无菌水冲洗3-5遍，接种于1/2MS培养基上，培养15-20天即可得到转基因试验所用的无菌苗。

本发明为了解决上述丹参种子消毒中，次氯酸钠浓度小，浸泡时间短，消毒不彻底，易污染；次氯酸钠浓度大，浸泡时间长，丹参种子发芽率受抑制，发芽时间长的问题。本发明采用合适浓度的次氯酸钠结合过氧化氢浸泡消毒的方法，利用过氧化氢同时具备杀菌和种子催芽的功效，不仅提高了消毒的彻底性，降低了污染率，还提高了丹参种子的发芽率和发芽势，大大缩短了发芽时间，提高了丹参无菌苗的制备效率。

作为本发明技术方案的进一步改进，无菌水每次冲洗的冲洗时间为1-3min。

与目前常用的采用田间丹参叶片经消毒和组织培养培育再生苗的方法相比，本发明解决了田间叶片培育受气候限制的问题，可以随时进行无菌苗制备，叶片经组织培养再生无菌苗周期长，一般需2个月以上，本发明用种子种植仅需15-20天。