[发明专利]一种狂犬病病毒灭活疫苗的纯化方法

说明书

本发明涉及一种狂犬病病毒灭活疫苗的纯化方法，所述的方法包括如下步骤：(1)以Vero细胞为病毒宿主接种并培养狂犬疫苗毒株，收获病毒浓缩液；(2)病毒灭活；(3)分子筛层析联用阴离子交换层析制备得纯化的灭活狂犬疫苗；本发明的方法不向疫苗中添加任何化学纯化剂,操作简单，工艺连贯性好且可避免病毒抗原纯化过程被稀释。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种狂犬病病毒灭活疫苗的纯化方法。

背景技术

狂犬病(Rabies)，是由狂犬病毒所致的自然疫源性或动物源性人畜共患急性传染病，流行性广、致死率极高，对人民生命健康构成严重威胁。目前疫苗预防接种仍是预防和控制狂犬病最有效的方法。自1885年路易巴斯德发明第一支人用狂犬病疫苗以来，狂犬病疫苗的发展经历了早期的动物神经组织疫苗、禽胚疫苗、细胞培养的粗制疫苗，到目前的经原代地鼠肾细胞、原代鸡胚细胞、原代鸭胚细胞、非洲绿猴肾细胞、恒河猴胎儿二倍体细胞、人二倍体细胞培养的纯化疫苗。

1980年前，我国生产和使用的是成年羊脑组织疫苗，接种后不良反应大，特别是由脑组织引起的变态性脑脊髓炎不良反应尤为严重，同时免疫效果也不够满意。为解决这些问题，我国于1965年开始由卫生部武汉生物制品研究所牵头，中国药品生物制品检定所、卫生部长春、兰州生物制品研究所等单位合作启动细胞培养疫苗研发工作，最终该疫苗于1980年应用并替代了羊脑疫苗。其中，冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)以其在生产工艺、经济效益和质量等方面的综合优势，占据了当前我国的大部分狂犬病疫苗市场。

Vero细胞作为一种传代细胞，其DNA存在与人体正常细胞进行作用，使人体正常细胞产生突变，从而导致癌变的风险^[1,2]。尽管目前国际上认为130-150代Vero细胞无致瘤性，可以应用于疫苗的生产，但促生长蛋白及细胞残留蛋白、潜在病毒、细胞残余等细胞基质使传代细胞疫苗的大量使用仍存在隐忧，因此为了确保疫苗的安全性，目前世界上许多机构组织对生物制品中的细胞残留量都制定了相关标准^[3]。我国现行药典(2015年第三版)就对生物制品中宿主细胞物质残留量做了明确规定，Vero细胞DNA残留量不高于100pg/剂(通则3407第一法)；总蛋白含量不高于80μg/剂(Lowry法)；Vero细胞宿主蛋白质(HCP)残留量不高于4μg/剂(采用酶联免疫法)；细菌内毒素不高于25EU/剂(凝胶限度实验)。

早期，狂犬病疫苗制品采用微孔滤膜过滤技术微滤去除组织碎片、脱落细胞或细胞碎片。其后，为提高疫苗效价，增加了超滤浓缩技术，一些小分子杂质也在超滤过程中被去除。上世纪七十年代建立的蔗糖区带超速离心纯化工艺和九十年代建立的凝胶过滤柱层析纯化技术，进一步提高了制品的纯度。此后，人用狂犬病疫苗制品纯化工艺不再有大的改进。国内外各种类型的狂犬病疫苗制品纯化工艺大致相同，依次为微滤澄清、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心或凝胶过滤柱层析。

随着疫苗质量要求的不断提高，人们对狂犬病疫苗纯化技术的改进尝试工作也从未停止，总结前人所尝试的方法有：用β-丙内酯使其失活后通过区带离心法纯化狂犬病病毒^[4]；浓缩病毒液依次经过阴离子交换色谱，阳离子交换色谱，金属鳌合亲和色谱处理^[5]；硫酸鱼精蛋白-琼脂糖凝胶层析和分子筛层析法先后对病毒液进行提纯^[6]；用特定波长的超声波处理浓缩病毒液，再经过分子筛层析提纯得到第一次纯化液，然后重复上述操作获得第二次纯化液^[7]；在接种病毒前，用含有丁酸钠和硫酸鱼精蛋白的PBS溶液清洗生产细胞，病毒收获液经分子筛复合离子层析纯化^[8]；用阳离子交换层析、核酸酶、蔗糖梯度超速离心依次对超滤浓缩病毒液进行处理从而实现纯化^[9]；通过可互换次序的阴离子交换层析和羟基磷灰石层析依次对病毒液进行提纯^[10]等。