[发明专利]一种狂犬病病毒灭活疫苗的纯化方法

权利要求书

1.一种灭活狂犬疫苗的生产方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)以Vero细胞为病毒宿主接种并培养狂犬疫苗毒株，收获病毒浓缩液；

(2)病毒灭活；

(3)分子筛层析联用阴离子交换层析制备得纯化的灭活狂犬疫苗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体步骤为：

1)将复苏后的单层Vero细胞以含牛血清的细胞培养基培养成均匀单层细胞；

2)将培养好的Vero细胞接种终末反应器，进行生物反应器细胞培养；

3)向上述步骤2)中培养完毕的Vero细胞中接种培养狂犬病病毒毒种；

4)病毒接种培养3天后开始收获病毒液，连续收集4～6天并合并病毒液后，浓缩病毒液获得病毒浓缩液，收获的病毒液总蛋白不超过10mg/ml。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

所述的生物反应器细胞培养的参数为：

生物反应器的体积75L～300L；

培养参数为：温度36.5±1℃、pH 7.25±0.2、pO₂ 30.0～80.0％、灌流量1～5个反应器工作体积/24小时、培养96～120小时后细胞数应达到(4.0～10.0)×10⁶cells/ml；

所述的接种狂犬病病毒毒种的参数为：

按0.01～0.1MOI接种狂犬病病毒毒种；

培养参数为：温度33～37℃、pH6.8～8.0、pO₂ 30.0～80.0％、灌流量为1～5个反应器工作体积/24小时；

所述的浓缩病毒液方法为：经0.2～0.45μm孔径滤芯澄清，再经300KD的膜包浓缩40～80倍。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)的具体步骤为：

1)按1：4000比例加入β-丙内酯原液，置2～8℃灭活48～72小时；

2)随后37℃水解2～4小时。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)的具体步骤为：首先进行分子筛层析，然后进行阴离子交换层析。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的分子筛层析技术参数为：

1)层析介质Sepharose 4Fast Flow，层析柱高度70～80cm；

2)平衡、洗脱缓冲液为pH 7.2～8.2的6～60mM PBS(50～500mM NaCl)，优选的，平衡、洗脱缓冲液为pH7.4～7.9的12～50mM PBS(100～400mM NaCl)；

3)平衡缓冲液用量为直至柱后流出液pH 7.2～8.2，优选的，平衡缓冲液用量为1.7～2.3个柱体积；

4)上样样品为步骤(2)获得的病毒灭活液，上样体积为3～8％柱体积；

5)上样、洗脱流速30～45cm/h，优选的，上样、洗脱流速为35～40cm/h；

6)使用紫外检测器检测波长280nm处的吸收值，收集第一个洗脱峰，得到粗纯疫苗。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的阴离子交换层析技术参数为：

1)层析介质Q Sepharose^TM XL，层析柱高度20～40cm；

2)平衡缓冲液为pH7.2～8.2的6～60mM PBS(50～500mM NaCl)，洗脱缓冲液为pH 6.8～7.8的6～60mM PBS(50～1000mM NaCl)，优选的，平衡缓冲液为pH7.4～7.9的12～50mMPBS(100～400mM NaCl)，洗脱缓冲液为pH7.1～7.6的12～50mM PBS(300～800mM NaCl)；

3)上样样品为层析后的粗纯疫苗，上样体积为15～40％柱体积；

4)上样、洗脱流速30～45cm/h，优选的，上样、洗脱流速35～40cm/h；

5)平衡缓冲液用量为8～12个柱体积；

6)使用紫外检测器检测波长280nm处的吸收值，收集第一个洗脱峰，获得纯化的灭活疫苗产品。