[发明专利]牙上皮细胞外泌体制备、外泌体植入物的制备及其应用

说明书

本发明公开了一种牙上皮细胞外泌体制备，包括以下步骤:(1)工程化牙上皮细胞系的处理；(2)工程化牙上皮细胞系上清液的获取；(3)工程化牙上皮细胞系提取液的获取；(4)工程化牙上皮细胞外泌体的获取。本发明还公开了一种胶原凝胶复合工程化牙上皮细胞外泌体植入物的制备方法。本发明还公开了一种工程化牙上皮细胞外泌体在体内促进牙周和牙髓再生中的应用。利用永生化的赫特维希上皮细胞系(HERS‑H1)长期稳定的扩增并且规模化制备牙上皮来源的外泌体。且由于外泌体不含有主要组织相容性复合体，避免了以干细胞为基础的再生中面临的免疫排斥问题，且外泌体易于储存与运输。

技术领域

本发明涉及生物医学工程技术领域，具体来说，涉及一种牙上皮细胞外泌体制备、外泌体植入物的制备及其应用。

背景技术

牙周炎是中老年人常见的口腔疾病之一，会导致牙槽骨的吸收及牙齿的松动，最终导致牙齿脱落。目前临床上以常规洁治刮治为主，只能延缓骨吸收进程，尚无根治的治疗方法。因龋病、各种创伤等引起的牙髓病是世界上最常见的口腔感染性疾病之一，可导致牙髓的炎症甚至坏死，然而根管治疗作为目前最有效的牙髓治疗手段，是以人工材料替代活性牙髓，造成牙髓的缺失，最终导致牙齿失活和牙齿脱落。组织工程技术的出现为牙周及牙髓组织修复开启了新的里程。从牙齿发育的角度来看，牙髓及牙周组织的形成是牙上皮与间充质相互作用的结果。所以，利用牙源性上皮干细胞与间充质干细胞相互作用被广泛应用于牙周及牙髓组织再生中。然而，牙源性干细胞的应用仍然有不少限制，例如干细胞获取程序的繁琐，牙源性干细胞数量的限制、细胞衰老以及潜在的致瘤风险等。

1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。外泌体是由细胞分泌的一种双层膜状结构的小囊泡，直径约40-150nm，携带了母细胞重要的信号分子，例如蛋白质、mRNA、miRNA和脂质等，通过与靶细胞的结合而调控细胞功能，参与细胞间交流。研究发现，在牙齿发育过程中，外泌体参与牙上皮及牙间充质的相互作用并在其中扮演重要角色。牙源性细胞外泌体可以保持着与其母细胞相似的生物学功能，牙源性上皮细胞来源的外泌体在促进牙源性间充质细胞向牙周组织分化及牙髓组织形成方面具有积极作用。

工程化的细胞系可以作为重要的科学研究工具，可以代替有限的原代细胞，实现长期并且稳定的细胞扩增。为解决原代牙上皮细胞来源少，取材困难的问题，本发明利用赫特维希上皮细胞系(HERS-H1)(该发明专利申请号为：201711205709.5，其中，赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1保藏号为CCTCC NO.C2017249)作为牙源性上皮细胞的来源，保证了工程化牙上皮细胞的长期稳定的扩展，并实现工程化牙上皮细胞外泌体规模化制备。同时，工程化牙上皮细胞外泌体也保持着与其母细胞相似的生物学功能，工程化牙上皮细胞来源的外泌体在促进牙周组织形成及牙髓组织再生方面具有积极的促进作用。

工程化牙上皮细胞外泌体在应用过程中也存在着许多难题，比如首先是外泌体支架材料的筛选，理想的支架材料首先需要安全无害，并且能够粘附和缓释外泌体，在体内可以逐渐吸收而不影响宿主的体内微环境；其次，因为外泌体的提取过程中会有一系列的物理化学操作，能否保证其安全无害上具有一定的难度。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种牙上皮细胞外泌体制备、外泌体植入物的制备及其应用，具有利用永生化的赫特维希上皮细胞系(HERS-H1)长期稳定的扩增并且规模化制备牙上皮来源的外泌体，且由于外泌体不含有主要组织相容性复合体，避免了以干细胞为基础的组织再生中面临的免疫源性问题，且外泌体具有易于储存与运输的优点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种牙上皮细胞外泌体制备，包括以下步骤:

(1)工程化牙上皮细胞系的处理：

1.1、取液氮保存的工程化牙上皮细胞系(HERS-H1)，用40-50℃温水复苏，接种于10cm培养皿中；